ECRG4在乳腺癌中的表达与调控机制及其抗肿瘤作用的研究

摘要

目的:
　　食道癌相关基因4(Esophageal cancer-related gene4，ECRG4)是从人类食管上皮细胞内分离出来的新基因，它因在食管鳞癌中的作用而首次被人们发现。其正式名称为C2ORF40，基因定位于染色体2q12.2，编码148个氨基酸残基的多肽。据有关文献报道，ECRG4在食管鳞癌、结直肠癌、前列腺癌和神经胶质瘤中均表达下调，在食管鳞癌和神经胶质瘤中起到抑制癌细胞的增殖、迁移和侵袭的功能。因此，在食管鳞癌、结直肠癌、前列腺癌和神经胶质瘤中ECRG4被看作是一个潜在的抑癌基因，但ECRG4的确切功能目前尚无定论。近年来，有研究发现在食管鳞癌、结肠癌和神经胶质瘤中都伴随着ECRG4启动子区CpG岛高甲基化的现象，推测可能是这种高甲基化现象引起了ECRG4的基因转录沉默，从而导致ECRG4表达下调。但是，ECRG4表达调控机制仍罕见报道。2011年有研究发现ECRG4在乳腺癌中表达下调且与无病生存率相关，本实验室的前期工作也发现在乳腺癌中ECRG4的表达是下调的，因此，我们决定针对ECRG4在乳腺癌中的表达与调控以及抗肿瘤功能进行进一步研究。本研究拟对ECRG4在乳腺癌组织的表达情况进行检测，探究在乳腺癌组织以及乳腺癌细胞系中ECRG4基因启动子区CpG岛的甲基化状态，探讨ECRG4启动子区CpG岛甲基化状态与其表达之间的关系，并初步探索ECRG4在乳腺癌中的抗肿瘤功能，以期找到新的诊断和预后指标，为以后的分子靶向治疗提供理论依据。
　　方法:
　　1.应用半定量RT-PCR和荧光定量PCR(Q-PCR)方法检测17例配对乳腺癌新鲜组织中内源性ECRG4的mRNA表达水平;
　　2.BSP（Bisulfite sequencing PCR）法检测17例配对乳腺癌新鲜组织ECRG4启动子区的甲基化状态;
　　3.应用BSP和荧光定量PCR(Q-PCR)检测5-Aza-CdR处理前后SK-BR-3和MCF-7细胞的甲基化状态及mRNA表达情况;
　　4.构建ECRG4-pcDNA3.1真核表达质粒，并用ECRG4-pcDNA3.1表达质粒或对照空质粒分别转染SK-BR-3和MCF-7细胞，转染48小时后收集细胞总蛋白，Western Blotting检测蛋白表达水平;
　　5.MTT法检测转染ECRG4表达质粒前后SK-BR-3和MCF-7细胞的增殖能力改变
　　6.流式细胞仪检测转染ECRG4表达质粒24 h后SK-BR-3和MCF-7细胞凋亡的改变
　　7.细胞划痕实验检测转染ECRG4表达质粒48 h后MCF-7细胞迁移能力的改变
　　结果:
　　1.RT-PCR结果显示有15例(15/17，88.2％)乳腺癌组织ECRG4的mRNA表达水平低于癌旁乳腺组织(P＜0.05);
　　2.RT-qPCR结果显示有16例(16/17，94.1％)乳腺癌组织ECRG4的mRNA表达水平低于癌旁乳腺组织(P＜0.01);
　　3.在乳腺癌组织中ECRG4启动子区存在明显的高甲基化现象;
　　4.5-Aza-CdR处理SK-BR-3和MCF-7细胞72 h后其ECRG4启动子区甲基化程度明显减弱， ECRG4 mRNA的表达得以恢复和上调，且具有5-Aza-CdR浓度剂量依赖性;
　　5.过表达ECRG4抑制了乳腺癌细胞系SK-BR-3和MCF-7的增殖(P＜0.05);
　　6.过表达ECRG4抑制了乳腺癌细胞系MCF-7的迁移(P＜0.05);
　　7.过表达ECRG4能够促进乳腺癌细胞系SK-BR-3和MCF-7的凋亡(P＜0.05)。
　　结论:
　　1.ECRG4在乳腺癌中mRNA表达水平下调;
　　2.在乳腺癌中ECRG4基因启动子区存在异常高甲基化，并且这种高甲基化状态与ECRG4在乳腺癌中的mRNA表达下调相关;
　　3.过表达ECRG4能够抑制乳腺癌细胞系SK-BR-3和MCF-7的增殖，并促进其凋亡;
　　4.过表达ECRG4能够抑制乳腺癌细胞系MCF-7的迁移。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词表

1 前言

2 主要的仪器设备和试剂

2．1 主要仪器

2．2 主要试剂

3 实验方法

3．1 RT-PCR检测

3．2 荧光定量PCR(RT-qPCR)

3．3 BSP法检测ECRG4启动子区甲基化状态

3．4 去甲基化药物5-Aza-CdR处理乳腺癌细胞系

3．5 ECRG4真核表达质粒的构建

3．6 质粒转染各细胞系

3．7 western Blotting检测蛋白表达情况

3．8 MTT法检测细胞生长抑制率

3．9 细胞凋亡检测

3．10 细胞划痕实验

3．11 统计学方法

4 结果

5．1 17例配对乳腺癌组织和癌旁乳腺组织中ECRG4 mRNA表达情况

5．2 17例配对乳腺癌组织和癌旁乳腺组织中ECRG4启动子区CpG岛的甲基化状态

5．3 乳腺癌组织中ECRG4启动子区甲基化状态与其mRNA表达的相关性分析

5．4 乳腺癌细胞系中ECRG4启动子区甲基化状态与其mRNA的表达水平的关系

4．5 去甲基化药物处理对ECRG4启动子区甲基化状态及其mRNA表达的影响

4．6 ECRG4-pcDNA3．1质粒表达的鉴定

4．7 过表达ECRG4对乳腺癌细胞增殖能力的影响

4．8 过表达ECRG4对乳腺癌细胞凋亡的影响

4．9 过表达ECRG4对乳腺癌细胞迁移能力的影响

5 讨论

6 结论

参考文献

8 综述 人食管癌基因4异常甲基化与癌症关系的研究进展

9 作者简历及在读期间所取得科研成果