内皮祖细胞Notch4信号通路在川崎病模型冠脉损伤及修复中作用的研究

摘要

研究背景:
　　川崎病(Kawasaki disease)，是一种自限性全身血管炎性综合征，为5岁以下婴幼儿的急性发热出疹性疾病，属于自身免疫炎症性疾病。由日本儿科医师Tomisaku Kawasaki在1967年首先报道，开始以为是罕见疾病，但目前川崎病已取代风湿热成为许多国家（亚裔国家多见）婴幼儿和儿童获得性心脏病的首要病因，也是我国常见的成人心血管疾病的病因之一。病程中内皮细胞坏死、脱落可以导致血管内膜受损、平滑肌层和胶原暴露、血小板凝聚，上述病理过程进而加重了炎症反应，使血管壁结构完整性被破坏，最终致冠脉狭窄或阻塞，甚至冠状动脉瘤。
　　内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells，EPCs)是血管内皮细胞的前体细胞，能够在内源性或（和）外源性刺激因素作用下促进内皮修复和血管新生，能够维持血管内皮完整性，从而维持血流动力学的稳定。组织缺血缺氧或内皮损伤时，骨髓EPCs被动员至外周血，通过增殖、迁移、归巢、分化整合至内皮缺损部位，参与血管损伤的修复以及微血管生成过程。促进EPCs的增殖、动员及分化，增加外周血循环EPCs的数量，将是冠状动脉损伤治疗的新方向。而目前关于内皮祖细胞的定义，生物学特性，动员、迁移、归巢及分化的具体过程及详细机制都不甚清楚或者存在很大争议。
　　Notch4信号介导的细胞间通讯在心血管发育及修复过程中有重要作用，Notch4信号通路是维持造血干细胞以及EPCs等细胞未分化状态的关键。EPCs表面存在Notch4受体，与相应配体结合后能够促进EPCs增殖、分化及动静脉转化等过程，在血管生成与修复中起重要调控作用，因此Notch4信号在EPCs生物活性调控和增殖、分化成熟中起到关键作用。
　　鉴于川崎病病因及发病机制仍不明确，而川崎病患儿EPCs状态的临床研究有限，且受到细胞间相互作用、药物干预及伦理学等多方面问题的制约，我们无法深入研究EPCs的真实状态。因此，本研究通过干酪乳杆菌细胞壁萃取物(LCWE)免疫刺激构建小鼠川崎病冠状动脉病变模型，检测小鼠骨髓EPCs含量及Notch4的表达，同时进行体外培养，研究川崎病冠状动脉损伤时，EPCs的含量、Notch4的表达及EPCs功能的改变，以及在mRNA和蛋白水平上Notch4及其下游信号RBP-Jκ的表达变化。
　　目的:
　　通过LCWE诱导川崎病冠脉损伤的小鼠模型，在其不同病程阶段探究骨髓EPCs含量、Notch4的表达和EPCs功能的改变及Notch4-RBP-Jκ信号通路在川崎病冠脉损伤及修复中的作用。
　　方法:
　　第一部分:小鼠骨髓EPCs的培养及功能检测与鉴定
　　1.用干酪乳杆菌制备干酪乳杆菌细胞壁萃取物（LCWE）。
　　2.BALB/C品系雄性小鼠，通过单次腹腔注射LCWE，建立小鼠川崎病冠状动脉损伤模型。
　　3.用密度梯度离心法获取小鼠骨髓单个核细胞，用EGM-2培养7天后进行相关检测。
　　4.细胞增殖活力检测:用CCK试剂盒检测细胞增殖活力，用酶标仪测定在450nm处的吸光度，并计算其活力。
　　5.细胞粘附能力检测:用胰酶消化细胞，并重新接种于24孔板内，置于培养箱内培养30min后，PBS冲洗后显微镜下计数贴壁细胞。
　　6.细胞迁移能力检测:用插入式Transwell24孔板检测细胞迁移能力，在显微镜下进行细胞计数。
　　7.体外血管形成能力:将EPCs接种于ECMatrix胶上，置于培养箱内培养，并于4、6、8、10、12h在显微镜下观察小（血）管生成情况。
　　8.免疫荧光
　　(1)免疫双荧光鉴定:用DiI-acLDL和FITC-UEA-I孵育细胞，用DAPI染核，于激光共聚焦显微镜下观察。
　　(2) RBP-Jκ和VEGFR-2免疫荧光检测:分别用RBP-Jκ和VEGFR-2抗体孵育细胞，用DAPI染核，于激光共聚焦显微镜下观察。
　　第二部分:检测川崎病不同病程阶段小鼠骨髓EPCs含量和Notch4的表达
　　1.分别取LCWE腹腔注射后3d，7d，14d，28d的小鼠及对等时间的对照组小鼠，分离出骨髓单个核细胞，用CD34-eFluro660，Notch4-PE，Flk-1-FITC，CD45-Percp-cy5.5标记细胞，用流式细胞术检测EPCs和Notch4(+)EPC的含量。
　　2.体外培养小鼠骨髓EPCs7天后，用胰酶消化细胞，制备细胞悬液，同样用流式细胞术检测EPCs和Notch4(+)EPC的含量。
　　第三部分:荧光定量PCR检测NOTCH4、RBP-Jκ信号通路、及内皮相关因子P-Selectin、VCAM-1的mRNA的表达
　　定量PCR检测体外培养的小鼠骨髓EPCs的NOTCH4、RBP-Jκ、P-Selectin、VCAM-1在mRNA水平的表达。
　　第四部分:Western Blot检测体外培养的小鼠骨髓EPCs的RBP-Jκ、VEGFR-2蛋白的表达
　　提取体外培养的小鼠骨髓EPCs的总蛋白，经过SDS-PAGE电泳，转膜，封闭，孵育一抗、二抗，加化学发光底物显色，显影等步骤，获得蛋白表达的影像，扫描并分析蛋白条带灰度值。
　　结果:
　　第一部分:体外培养的小鼠骨髓EPCs的功能检测与鉴定
　　1.体外培养的川崎病小鼠模型骨髓EPCs集落形成能力显著降低。
　　2.体外培养的川崎病小鼠模型骨髓EPCs的增殖活力明显低于对照组。
　　3.体外培养的川崎病小鼠模型骨髓EPCs的粘附能力明显低于对照组。
　　4.体外培养的川崎病小鼠模型骨髓EPCs的迁移能力明显低于对照组。
　　5.体外培养的川崎病小鼠模型骨髓EPCs的体外血管形成能力能力明显低于对照组。
　　6.免疫荧光
　　(1)免疫双荧光鉴定:各LCWE处理组双阳性率明显低于对照组。
　　(2) RBP-Jκ阳性表达率:LCWE处理组在3d组、7d组、14d组明显低于对照组。
　　(3) VEGFR-2阳性表达率:LCWE处理组在3d组、7d组、14d组明显低于对照组。
　　第二部分:小鼠骨髓EPCs的含量和Notch4的表达
　　1.取骨髓单个核细胞直接流式检测结果:各LCWE处理组的EPCs含量明显低于对照组。而LCWE处理组在3d组、7d组、14组Notch4(+) EPCs含量却明显高于对照组，28d组Notch4(+) EPCs含量虽然也高于对照组，但差异无显著统计学意义。
　　2.体外培养的川崎病小鼠模型骨髓EPCs含量明显低于对照组。而Notch4(+)EPCs含量却明显高于对照组。
　　第三部分:体外培养的小鼠骨髓EPCs的NOTCH4、RBP-Jκ、P-Selectin、VCAM-1的mRNA水平
　　1.NOTCH4 mRNA:3d组LCWE处理组的mRNA表达水平明显低于对照组。
　　2.RBP-Jκ mRNA:3d、7d组LCWE处理组的mRNA表达水平明显低于对照组。
　　3.P-Selectin mRNA:3d组LCWE处理组的mRNA表达水平明显低于对照组。
　　4.VCAM-1 mRNA:各LCWE处理组与对照组差异均无显著统计学意义。
　　第四部分:体外培养的小鼠骨髓EPCs的RBP-Jκ和VRGFR-2蛋白的表达
　　1.RBP-Jκ蛋白:3d组LCWE处理组RBP-Jκ蛋白表达明显低于对照组。
　　2.VRGFR-2蛋白:各LCWE处理组与对照组差异均无显著统计学意义。
　　结论:
　　1.川崎病小鼠模型的骨髓EPCs数量明显减少。
　　2.川崎病小鼠模型的骨髓EPCs的各项功能和生物活性严重受损。
　　3.Notch4-RBP-Jκ信号通路参与了川崎病冠脉损伤及修复，其具体机制需要进一步研究。

目录

声明

致谢

摘要

英文缩写词与中英文索引

1 引言

2 材料与方法

2．1 材料

2．2 实验方法

3 结果

3．1 第一部分：小鼠骨髓EPCs的培养及功能检测与鉴定

3．2 第二部分：小鼠骨髓EPCs的含量和Notch4的表达

3．3 第三部分：体外培养的小鼠骨髓EPCs的NOTCH4、R1BP-Jκ、P-Selectin、VCAM-1的mRNA表达

4 讨论

5 结论

参考文献

综述

作者简历及在学期间所取得的科研成果