拟南芥U-box E3泛素连接酶PUB19生物学功能及互作蛋白结构和功能分析

摘要

环境胁迫，如极端温度、干旱、盐害、氧化胁迫等严重威胁着蔬菜的产量和品质。深入研究植物对逆境胁迫的响应机制，可以为蔬菜抗逆遗传改良提供新思路，从而对于提高蔬菜的产量和品质以及发展中国特色的农业有重要的意义。
　　当植物受到胁迫时，植物会激活一系列的细胞生理过程应对胁迫。细胞自我吞噬是这些细胞生理过程之一。细胞自我吞噬是广泛存在于真核细胞中的一种溶酶体依赖性的降解途径，是细胞内物质成分利用溶酶体或液泡被降解过程的统称，它是真核细胞所特有的。自噬会被多种非生物胁迫所诱导，包括营养缺乏、氧化、盐害、干旱以及其它胁迫。在高温等胁迫下，植物体内受损伤的蛋白会通过自噬作用清除，而被清除的受损蛋白需要被泛素化，但是迄今为止，植物中负责吞噬蛋白泛素化的连接酶还没有被鉴定。
　　本文以十字花科植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)为材料，通过遗传学、分子生物学等手段从基因表达和蛋白水平研究了U-box E3泛素连接酶PUB19(Plant U-box Protein)的生物学功能及其互作蛋白的结构和功能。因为拟南芥与白菜和甘蓝类蔬菜同属于十字花科，高度同源，因此先在模式植物拟南芥上进行研究，对于十字花科类蔬菜同样有重要的指导意义。主要结果如下:
　　1.AtPUB19在非生物胁迫中发挥着不同的重要作用。盐害、干旱、低温、高温都能显著诱导PUB19及其同源基因PUB18上调表达，但PUB19上调表达更显著。对突变体pub19-1和pub19-3进行了高温、干旱、黑暗、低温抗性验证。研究发现AtPUB19沉默后，降低了对高温的抗性。但是，AtPUB19沉默增强了对干旱的抗性。因此，AtPUB19在非生物胁迫中可能发挥着不同的重要的作用。
　　2.运用酵母双杂交技术筛选AtPUB19相互作用的蛋白。以AtPUB19蛋白的全长为诱饵，采用酵母双杂系统筛选拟南芥cDNA文库，筛选到的阳性酵母单克隆，用缺陷板验证，LacZ报告基因的活性，ONPG法定性。经测序比对，最终筛选到两个基因，分别是DUT1(Dutp-Pyrophosphatase-Like1)以及LSU3(Response to Low Sulphur3)。
　　3.与PUB19互作的两个蛋白LSU和DUT1初步的结构和功能分析。拟南芥中LSU家族的四个蛋白高度相似。这四个蛋白都与PUB19在不同程度上互作，而PUB19同源蛋白PUB18并不能与LSU互作，说明PUB19与LSU是特异性互作。在缺硫胁迫中，发现了LSU基因家族和PUB19能被诱导表达，其中LSU1最为显著，并且在根和叶中都存在，表明PUB19与LSU都参与到了缺硫胁迫中。首次揭示了PUB19和矿质元素之间的关系。研究发现DUT1能够在高温、黑暗以及干旱胁迫中被抑制表达。筛选了DUT1T-DNA插入突变体，但是发现植株全部死亡，说明DUT1的敲除突变体不能用T-DNA插入突变体方式进行。实验构建了带有myc标签的DUT1的过表达载体到野生型拟南芥以及pub19突变体中，并进行一系列的非生物胁迫，实验发现，pub19/35S:DUT1突变体在黑暗以及氧化胁迫诱导的胁迫中表现出了敏感性，说明了PUB19与DUT1功能上密切相关。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词表

1 引言

1．1 植物蛋白降解的功能和途径

1．1．1 蛋白降解在植物生长发育中以及抗逆胁迫中的作用

1．1．2 蛋白降解的两条途径

1．1．3 自噬和泛素蛋白酶体途径在植物生长发育和逆境响应中的作用

1．2 E3泛素链接酶特异性的参与到蛋白酶体途径和自噬中

1．2．1 泛素化蛋白酶体途径和自噬之间的联系

1．2．2 E3泛素链接酶特异性的参与到蛋白酶体途径和自噬中

1．3 植物中PUB家族的结构和功能

1．3．1 植物中的U-box E3泛素连接酶

1．3．2 PUB蛋白功能及其在抗逆响应中的作用

1．4 dUTP与硫合成

1．4．1 dUTP的功能

1．4．2 LSU类蛋白和缺硫胁迫

1．5 全文目的和意义

2 拟南芥U-box E3泛素连接酶PUB19的生物学功能

2．1 材料与方法

2．1．1 拟南芥的基因型、生长条件以及MS培养基播种拟南芥的方法

2．1．2 非生物胁迫下AtPUB19基因被诱导的处理条件

2．1．3 非生物胁迫下pub19-1和pub19-3突变体响应分析

2．1．4 CTAB法提取植物总DNA

2．1．5 总RNA提取和cDNA合成

2．1．6 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析

2．2 结果

2．2．1 拟南芥pub19突变体鉴定

2．2．2 AtPUB19生物信息学分析

2．2．3 拟南芥在高温、低温、干旱、盐害下AtPUB19基因被诱导表达

2．2．4 拟南芥pub19基因沉默后降低了对高温的抗性

2．2．5 拟南芥pub19基因沉默后提高了对干旱的抗性

2．3 讨论

3 运用酵母双杂交技术手段筛选与AtPUB19互作蛋白

3．1 材料与方法

3．1．1 菌株和文库

3．1．2 酵母表达载体构建

3．1．3 文库的滴定

3．1．4 酵母感受态制备及转化

3．1．5 酵母筛库方法

3．1．6 X-gal显色法

3．1．7 ONPG测定法

3．1．8 酵母质粒提取以及转入大肠杆菌并提取质粒

3．1．9 酶切鉴定

3．1．10 酵母相关培养基配置方法

3．1．11 IPTG蛋白诱导以及蛋白纯化

3．2 结果

3．2．1 诱饵载体以及PBD-GAL4-PUB19成功构建

3．2．2 诱饵蛋白在YRG-2酵母菌中不存在自激活和毒性现象

3．2．3 拟南芥cDNA文库的滴定测定及扩增

3．2．4 文库的初步筛选以及酶切鉴定

3．2．5 阳性克隆回转一一对应验证

3．2．6 PET32a-DUT1原核表达和蛋白纯化

3．3 讨论

4 与AtPUB19互作蛋白LSU3和DUT1初步的结构和功能分析

4．1 材料与方法

4．1．1 植物材料

4．1．2 DUT1-Myc表达载体、DUT1-GFP、LSU-PAD、PUB18-PBD载体构建，

4．1．3 DUT1转基因株系的产生

4．1．4 DUT1转基因株系的检测

4．1．5 AtDUT1亚细胞定位

4．1．6 霍兰格式培养基配方(改造过的配方)

4．1．7 胁迫处理方法

4．2 结果

4．2．1 拟南芥LSU家族结构分析

4．2．2 LSU蛋白与AtPUB19蛋白特异性的互作，与AtPUB18蛋白不互作

4．2．3 拟南芥LSU1-4以及PUB19在缺硫胁迫下被诱导表达

4．2．4 LSU1-4在WT与pub19突变体植株在缺硫胁迫下的表达分析

4．2．5 缺硫胁迫下WT与pub19突变体植株的幼苗的生长情况

4．2．6 DUT1细胞核和细胞膜中均有分布

4．2．7 DUT1在一系列非生物胁迫中下调表达以及同源序列结构分析

4．2．7 DUT1转基因株系的鉴定

4．2．8 DUT1基因过表达后降低了对黑暗和氧化胁迫的抗性

4．3 讨论

5 总结与展望

参考文献

个人简历