间充质干细胞复合多孔支架修复骨与软骨缺损的实验性研究

摘要

软骨缺损在运动损伤中非常常见，临床中表现为膝关节疼痛，处理不当可能导致关节绞索、关节畸形等，最终导致骨关节炎的发生，严重影响患者的生活质量。关节软骨本身血供较差，成熟的软骨细胞发生损伤后依靠自体的修复能力有限。目前临床上采用关节软骨钻孔、微骨折等多种治疗方法尝试修复缺损的软骨，但长期临床效果难以让人满意。当软骨损伤累及软骨下骨时，治疗更为困难。由于开放性损伤、慢性骨髓炎和骨肿瘤切除引起的骨缺损是目前临床实践中的另一项难题。治疗骨缺损的金标准取自体骨植骨术，但取自体骨存在供区损伤和供区骨量有限的局限。异体骨移植存在免疫排斥骨愈合缓慢等问题。
　　近些年来，组织工程技术为骨和软骨缺损的治疗提供了新的途径。骨髓间充质干细胞因具有良好的多向诱导分化潜能是目前研究最多的种子细胞。近些年脂肪来源间充质干细胞具有来源丰富、扩增能力强，同时可以多向诱导分化逐渐成为组织工程领域研究热点。三维支架在组织工程中起着支持引导干细胞增殖并提供三维构建模板的作用。近些年来合成材料应用逐步增多，PLGA是目前FDA批准的可以用于人体组织工程的支架材料，具有降解速度可调节和良好的机械性能，但是组织相容性差，很多研究学者尝试对PLGA支架进行修饰改善其组织相容性取得了一定的成效。明胶海绵是另一种目前临床中广泛应用的商业化产品，因其多孔状结构、良好的组织相容性以及可降解性同时也是一种良好的组织工程支架。
　　在软骨修复中软骨下骨占据重要地位，本研究拟采用羟基磷灰石(HA)改善PLGA组织相容性，同时羟基磷灰石具有骨诱导和骨传导有利于软骨下骨的再生。
　　骨发生的方式分为膜内成骨和软骨内成骨，长骨自然发生的方式和骨折保守治疗的愈合方式均为软骨内成骨。研究表明软骨内成骨可以加速骨愈合，有利于再生骨的血管化。本研究拟采用明胶海绵作为多孔支架，采用体外诱导ADSC软骨分化进行体内修复大鼠软骨缺损，进一步明确软骨内成骨在大鼠骨缺损愈合中的作用。
　　本研究主要分为三部分:(1) PLGA/NHA支架的构建以及MSC在支架上的增殖分布;(2) PLGA/NHA多孔支架修复大鼠关节软骨缺损的实验研究;(3)明胶海绵多孔支架复合成软骨诱导ADSC经软骨内成骨修复大鼠节段性骨缺损的实验研究。
　　第一部分 PLGA/NHA支架的构建以及MSC在支架上的增殖分布
　　目的:构建PLGA/NHA支架，并研究MSC在支架上的增殖和分布情况。
　　方法:采用热诱导相分离技术制备PLGA/NHA多孔支架，并采用扫描电镜、力学测试等研究材料的特征。取第三代MSCs，通过MTT、DNA定量实验了解细胞在支架上的增殖情况;通过扫描电镜和CM-DiI荧光染色了解MSC在支架上的粘附分布情况。
　　结果:本研究中的PLGA/NHA支架呈多孔状，平均孔隙率为88.3％±2.8％。生物力学测试结果显示PLGA/NHA支架的弹性模量要大于PLGA支架。MTT和DNA定量结果显示MSC在PLGA/NHA多孔支架上的增殖数量显著高于PLGA多孔支架。扫描电镜显示MSCs在PLGA/NHA支架孔壁上铺展良好并分泌大量基质，激光共聚焦显微镜显示MSCs在PLGA/NHA支架上比PLGA多孔支架上细胞数目更多分布更密集。
　　结论:添加纳米HA颗粒可以改善MSC在PLGA支架上的生长、粘附和PLGA支架的机械性能，通过NHA修饰的PLGA可以作为组织工程支架用于修复骨软骨缺损。
　　第2章 PLGA/NHA多孔支架修复大鼠关节软骨缺损的实验研究
　　目的:观察PLGA/NHA多孔支架复合骨髓间充质干细胞修复大鼠关节骨软骨缺损以及移植MSC最终分化命运。
　　方法:分离MSC并用CM-DiI进行标记，将MSC接种到PLGA/NHA和PLGA支架上，植入大鼠股骨远端直径1.5mm全层骨与软骨缺损处，分别在术后6周和12周处死，进行大体观察、HE染色、番红染色以及免疫组化染色等进行评价骨软骨修复情况。
　　结果:研究结果发现术后12周PLGA/NHA-MSCs组软骨缺损处再生的软骨为光滑透明软骨，富含GAG和Ⅱ型胶原，但是不合Ⅰ型胶原。我们通过CM-DiI追踪MSCs研究发现，CM-DiI标记的细胞在术后12周仍位于修复区域。
　　结论:PLGA/NHA复合MSC可以有效的修复关节骨软骨缺损，改善软骨修复质量，移植的MSC可以在骨软骨修复早期大量存活，改善局部再生微环境，而不需要再添加生长因子。PLGA/NHA复合MSC可以作为一种修复骨软骨缺损的有效组织工程材料，可以进一步在临床上应用。
　　第3章明胶海绵多孔支架复合成软骨诱导ADSC经软骨内成骨修复大鼠节段性骨缺损的实验研究
　　目的:研究明胶海绵多孔支架复合经成软骨诱导的ADSC经软骨内成骨修复大鼠节段性骨缺损的效果。
　　方法:取大鼠腹股沟脂肪按照贴壁法分离ADSCs，将分离的ADSC进行成骨、成脂和成软骨分化诱导进行鉴定。将明胶海绵支架切成方形，扫描电镜观察明胶海绵结构。将ADSCs接种到明胶海绵支架上，并进行DNA定量检测评价ADSC在支架上的增值情况。创建大鼠胫骨骨缺损（2mm）模型。将接种在明胶海绵支架上的ADSC进行成软骨诱导（ADSC-CD）14天，大鼠胫骨缺损处分别采用空白、明胶海绵、明胶海绵-ADSC、明胶海绵-ADSC-CD组进行填充。分别在术后2周、4周和8周取材大鼠胫骨进行X线、microCT影像学评估，进行病理染色评价成骨以及成软骨情况。
　　结果:研究发现我们分离的ADSC可以进行多向分化，ADSC在明胶海绵多孔支架上增殖良好。动物研究发现大鼠骨缺损术后2周明胶海绵-ADSC-CD组已经出现富合GAG的基质和软骨细胞，这表明已经启动软骨内成骨，而空白组和明胶海绵组未见明显GAG基质和软骨细胞出现。术后8周X线和miroCT发现明胶海绵-ADSC-CD组胫骨完全愈合，番红O染色表明软骨内骨化已经完成;而明胶海绵-ADSC组胫骨CT仍可见部分骨折线，番红O染色表明仍有部分GAG在钙化改建;空白组和明胶海绵组则骨折线仍清晰可见，番红O染色表明骨折端仍富含GAG软骨基质，表明骨折仍处于软骨内成骨过程中。
　　结论:明胶海绵复合成软骨诱导的ADSC可以加速软骨内成骨，加速骨折愈合，提高骨修复的质量。因为明胶海绵作为支架获取简单，临床可行性强，在临床中应用中有广阔的前景。

目录

声明

致谢

摘要

缩写及符号清单

主要实验仪器

绪论

第1章 PLGA／NHA支架的构建以及MSC在支架上的增殖分布

1．1 前言

1．2 实验材料与方法

1．3 结果

1．4 讨论

1．5 结论

第2章 PLGA／NHA多孔支架修复大鼠关节软骨缺损的实验研究

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．3 结果

2．4 讨论

2．5 结论

第3章 明胶海绵多孔支架复合成软骨诱导ADSC经软骨内成骨修复大鼠节段性骨缺损的实验研究

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．3 结果

3．4 讨论

3．5 结论

全文总结

参考文献

综述 骨组织工程的研究进展

作者简历