ACTL6a在正常和银屑病表皮角质形成细胞中的作用研究

摘要

背景：
　　肌动蛋白相关的蛋白(Actin related proteins，Arps)是由一组新近发现的，高度保守的蛋白分子超家族组成，这些蛋白分子有与传统的肌动蛋白类似的序列，与肌动蛋白共同组成了染色质重塑酶复合体。近几年研究发现Arps除了作为细胞骨架的组成成分，还可以影响转录。核内的肌动蛋白样-6a(Actin like6a，ACTL6a，又叫Arp4，BAF53)能够和组蛋白核心结合，促进染色质重塑复合体和和核小体的结合，在调控基因表达，DNA复制和其它染色质活动中发挥重要作用。皮肤表皮是一种在干细胞自我更新和分化中维持动态平衡的组织，表皮基底层的干细胞持续分化形成了棘层，表达细胞骨架蛋白角质蛋白-1和角质蛋白-10。细胞继续分化，形成了颗粒层，表达分化蛋白Fillaggrin和Loricrin。新近的研究发现ACTL6a是一种在干细胞功能调控中发挥重要作用的因子，条件性的敲除ACTL6a会引起表皮的终端分化，周期阻滞和分化不全，而过表达ACTL6a会促进干细胞处于前体状态，抑制细胞分化。哺乳动物的ACTL6a和β-actin作为SWI/SNF样的BAF染色质重塑复合体，可以通过N端的组蛋白尾的修饰和参与组蛋白-DNA相互作用改变染色体的结构。ACTL6a还通过拮抗SWI/SNF依赖的KLF4活化以及别的表皮分化相关基因维持未分化的干细胞前体状态。但是人们对ACTL6a在表皮角质形成细胞中发挥作用的确切机制还不是很清楚。
　　组蛋白调节酶，染色质重塑复合体，组蛋白的甲基化和乙酰化被认为是帮助基因组排列在特定的染色质区域内内在表观遗传学机制。尤其是赖氨酸甲基化和染色质重塑酶一起在细胞分化，凋亡和器官形成过程中的染色质动态变化中发挥重要作用。近些年，基因组范围内的甲基化调节也被证实和多种疾病的发病和进展相关。银屑病是一种由多因素引起的与含有表皮干细胞的基底层静止细胞群高度增生相关的免疫异常性慢性炎症增生性皮肤病。越来越多的抑癌基因以及免疫相关基因的启动子甲基化已经在银屑病皮损的研究中被发现。
　　但是目前为止，还没有研究探索ACTL6a在正常及银屑病角质细胞核内表观遗传学过程及细胞功能中的作用，本文研究对比了ACTL6a在银屑病皮肤以及正常皮肤中的表达，并就ACTL6a和异染色质蛋白HP1γ的相互作用，ACTL6a在表皮角质形成细胞中的表观遗传学调节作用，在角质细胞活动中的调节作用做一研究，为探讨ACTL6a参与银屑病发病的可能机制打下基础。
　　目的：
　　明确ACTL6a和HP1γ在正常皮肤组织和银屑病皮肤组织中的表达情况，及相应组织来源细胞中的表达，研究ACTL6a是否还可以通过HP1γ发挥调节核内染色质重塑的作用;研究ACTL6a高表达对角质细胞核内甲基化调节，乙酰化调节，以及一系列分化相关角质蛋白表达的影响;明确ACTL6a高表达对表皮角质形成细胞增殖，迁移，衰老，氧化应激的作用。
　　方法：
　　第一部分:用组织免疫荧光法对ACTL6a和HP1γ在正常皮肤组织，银屑病非皮损区，皮损区，邻近皮损区皮肤中的表达进行定位，并用细胞免疫荧光技术和免疫印迹法定位，定量检测了ACTL6a和HP1γ在正常皮肤组织来源的角质形成细胞，银屑病非皮损区，邻近皮损区，皮损区皮肤组织来源的角质形成细胞中的定位及表达。
　　第二部分:使用慢病毒介导的ACTL6a过表达系统转染正常角质形成细胞，提取总RNA和蛋白质。以逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹检测慢病毒介导的ACTL6a的过表达效率。以细胞荧光方法和Western-blot检测ACTL6a过表达的角质形成细胞胞核内HP1γ的表达。
　　第三部分:研究ACTL6a过表达后组蛋白-3赖氨酸位点甲基化的影响和定位变化，以Western-blot法检测ACTL6a高表达对细胞核内组蛋白乙酰化的影响，探讨ACTL6a高表达细胞表观遗传学的改变。
　　第四部分:用慢病毒转染正常皮肤组织来源的KCs，检测ACTL6a过表达对角蛋白K1，K2，K10、K14、K16，Involucrin，Loricrin以及整合素β1、E-cadherin蛋白表达水平的影响，分别用MTS法，transwell法，β半乳糖苷酶细胞衰老试剂盒和氧化应激试剂盒检测ACTL6a过表达的KCs和正常KCs细胞增殖能力，迁移能力，细胞衰老和氧化应激的改变。
　　结果：
　　一、ACTL6a和HP1γ在正常皮肤组织和银屑病皮肤组织以及细胞中的表达:
　　1)组织免疫荧光:ACTL6a和HP1γ在正常皮肤组织和银屑病皮损区，临近皮损区以及非皮损区组织中除了角质层外的表皮全层均有表达;ACTL6a在正常皮肤和银屑病来源的皮肤组织中均呈现明显的细胞核表达，但是HP1γ在正常皮肤和银屑病来源的皮肤组织中的分布模式有所不同。
　　2) Western-blot:体外培养的银屑病临近皮损区来源的KCs中ACTL6a和HP1γ蛋白的表达均高于皮损区，非皮损区，以及正常皮肤组织来源的KCs。
　　3) RT-PCR:体外培养的银屑病皮损区组织来源的KCs中ACTL6a的表达高于正常角质形成细胞中的表达。
　　二、ACTL6a过表达促进HP1γ在KCs核周的聚集。
　　在正常组织来源的KCs中，HP1γ均匀分布于细胞核内，在空白质粒组HP1γ主要分布在细胞核中心，而在慢病毒介导的ACTL6a高表达的KCs细胞核内，HP1γ分布集中在核周区域。但是ACTL6a过表达的KCs中HP1γ整体蛋白量的表达与正常KCs相比没有明显变化。
　　三、ACTL6a过表达引起组蛋白-3的甲基化调节以及组蛋白的乙酰化调节。
　　高表达ACTL6a的KCs中一系列组蛋白-3赖氨酸位点上的整体甲基化水平与正常对照组KCs相比不同;经过ACTL6a慢病毒处理后的KCs核内多种组蛋白甲基化的亚细胞定位也与正常对照组的KCs不同;过表达ACTL6a的KCs中乙酰化Histone2a及乙酰化Histone3的水平比对照组KCs升高，组蛋白去乙酰化酶的水平比对照组降低。
　　四、过表达ACTL6a能改变细胞分化状态，引起角质细胞分化相关蛋白K10,K14，Involucrin和Loricrin降低。
　　五、慢病毒介导的ACTL6a过表达能增强体外培养的KCs增殖、迁移能力，抑制KCs的衰老和氧化应激。
　　结论：
　　一，在银屑病皮肤组织和正常皮肤组织中均表达ACTL6a和HP1γ，ACTL6a在两种皮肤组织中的分布一致，但HP1γ在两种皮肤组织中的分布模式不同。
　　二，ACTL6a和HP1γ在银屑病来源的角质细胞中的表达高于正常角质形成细胞。
　　三、ACTL6a在角质形成细胞中的过表达促进了核内HP1γ在核周的重定位。
　　四、ACTL6a在角质形成细胞中的过表达调节了组蛋白的赖氨酸位点甲基化和组蛋白的乙酰化过程。
　　五、ACTL6a在角质形成细胞中的表达可能与细胞分化相关，并参与了表皮角质形成细胞的增殖、迁移、衰老、氧化应激。
　　六、银屑病角质形成细胞中高表达的ACTL6a可能参与银屑病的发病机制。
　　七、对ACTL6a促进核内HP1γ亚细胞定位改变的机制研究不够深入，以及ACTL6a和HP1γ在角质形成细胞内发挥作用涉及的具体基因及信号通路的探讨不深入是本项研究的局限。

目录

声明

致谢

摘要

英文缩写注释

研究背景

第一部分 ACTL6a在表皮角质形成细胞和银屑病中的表达

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

第二部分 ACTL6a过表达促进HP1γ在核周聚集

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

第三部分 ACTL6a过表达参与甲基化及乙酰化调节

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

第四部分 ACTL6a过表达影响角质形成细胞功能

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述

在读期间科研成果及所获得奖励

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