CRISPR/Cas9基因敲除技术在家蚕基因功能研究中的应用

摘要

家蚕是重要的吐丝营茧昆虫，也是生物研究的模式昆虫之一。CRISPR/Cas9基因敲除系统是近两年发展起来的一种来源于细菌获得性免疫系统的基因编辑技术，经过人工的改造，目前已被广泛运用于多种模式生物的研究，成为一种强大的研究工具。本研究分别选择了家蚕体壁等颜色相关和丝腺发育相关的两类基因，利用CRISPR/Cas9系统敲除基因后获得突变体，成功建立了一套高效快速的家蚕基因敲除技术体系，为家蚕功能基因组学的研究提供了一个有力的工具。同时，对敲除了丝腺相关基因的家蚕个体进行了转录组测序RNA-seq，初步阐释了家蚕丝腺发育的分子机制。主要结果如下:
　　1.运用CRISPR/Cas9系统成功敲除了家蚕4个与体壁等透明性及颜色相关的基因Bm-ok、BmKMO、BmTH、Bmtan。根据靶点设计原则，对这4个基因共设计了8个靶点，其中BmTH3个，Bm-ok、Bmtan各2个，BmKMO仅1个靶点。将体外合成的高质量的Cas9-mRNA和sgRNA混合后显微注射到家蚕刚产的卵内，结果表明这8个靶点的sgRNA均发挥了敲除效应，敲除的突变率大概为16.7％-35.0％，但不同基因不同靶点的突变率不同，如Bmtan2个靶点，突变率仅16.7％。由于Cas9蛋白切割DNA后突变是随机发生的，所以4个基因的突变类型多种多样，删除和插入(indel)的碱基数目不可预测，同时注射一个基因的多个sgRNA，可能仅在1个靶点处发生突变，也可能多个靶点同时发生突变，从而发生大片段的删除。但是1个靶点也会发生大片段的删除，如BmKMO在靶点处删除了240 bp和289 bp长的片段。通常CRISPR/Cas9存在发生脱靶效应的可能，从而对个体造成危害。但本实验检测结果并无明显的脱靶发生，所以该CRISPR/Cas9系统用于基因敲除特异性高。本研究成功得到了Bm-ok突变体，其G0代表现为嵌合体表型，表皮成块状透明，而G1代纯合体表皮即完全透明，似“油蚕”。
　　2.运用CRISPR/Cas9系统成功敲除了与家蚕丝腺发育相关的基因Bmsage。针对Bmsage基因的结构设计了1个靶点，敲除的突变率约为46.7％，高于4个体壁相关基因的突变率。随机选择了7个与靶点相似度最高的脱靶靶点，检测了Bmsage靶点的脱靶效应，结果未发现有明显的脱靶发生。通过测序筛选出了Bmsage纯合突变体，并从G2代中筛选出了其不同于野生型的突变表型，即丝腺发育畸形，仅保留了完整的ASG和一小段MSG，而缺失了PSG。该突变体熟蚕失去了吐丝的本能，存活下来的突变体最终形成了完全的裸蛹，但可以正常化蛾、交配和产卵。部分突变体会在化蛹期间死亡，或保持幼虫虫态或形成畸形的蛹。同时还解剖了蚁蚕的丝腺，发现其表型与五龄期一样，并分离出两种不同基因型但表型一致的突变体，也均缺失中后部丝腺，从而确认了Bmsage突变体的丝腺缺失表型是Bmsage基因敲除的结果，因此Bmsage可能参与了家蚕胚胎期丝腺的生成和发育。
　　3.对敲除后的G0代嵌合体，通过交配策略1（G0代mosaic×WT）可以用来评估突变的germline概率，Bm-ok的germline概率约为28.6％，而Bmsage的germline概率约为75％，可见该CRISPR/Cas9基因敲除系统具有很高的突变遗传概率，足以从G1代中筛选出纯合突变体。通过交配策略2（G0代mosaic×mosaic），可以快速获得纯合突变体，缩短筛选时间，Bm-ok G0代突变体交配后，G1代中高达90％以上的个体均表现为透明表皮，但得到的纯合突变体的基因型不一定相同，两条染色体上的等位基因可能有差异，所以得到的是复合型杂合子。
　　4.对Bmsage丝腺缺失型突变体的RNA-seq结果分析，初步了解了Bmsage可能参与的生理生化过程。GO结果显示Bmsage基因功能缺失后，对家蚕生理功能的影响主要集中在一些细胞组分，如与肌肉功能相关的肌球蛋白和肌钙蛋白基因都表现出明显的上调，碳水化合物代谢相关的基因如多种凝集素基因和糖苷酶基因，除个别下调外，其他也均上调。而排在前10的GO中，出现较多的是与几丁质分解代谢相关的几丁质酶基因和多种丝氨酸蛋白酶抑制剂基因。KEGG分析显示Bmsage基因主要与一些糖类、脂类和氨基酸的代谢的信号通路相关，其中又以糖类代谢为主，如半乳糖代谢、糖胺聚糖降解及氨基糖和核苷酸糖代谢，所以Bmsage可能参与了多个糖类代谢途径。在差异基因中与丝腺发育相关性最大的是几丁质酶基因、β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因和丝氨酸蛋白酶抑制剂基因，以及一些转运RNA基因，如TRNAE-CUC、TRNAN-G UU、TRNAD-GUC和TRNA V-GAC。因此Bmsage可能通过复杂的调控网络，参与了丝腺组织的分化与形成过程。

目录

声明

摘要

主要英文缩写与译名

第一章 文献综述

1．引言

2．CRISPR／Cas系统介绍

2．1 CRISPR／Cas系统的来源

2．2 CRISPR／Cas系统的组成和结构特点

2．3 CRISPR／Cas系统的工作机理

3．CRISPR／Cas9系统的应用

3．1 CRISPR／Cas9研究现状

3．2 CRISPR／Cas9在基因编辑中的应用

3．3 CRISPR／Cas9敲除基因的机制

3．4 CRISPR／Cas9脱靶效应

3．5 CRISPR／Cas9其他方面的应用

4．家蚕丝腺介绍

4．1 家蚕丝腺的形态特点与功能

4．2 家蚕丝腺的组织结构

4．3 家蚕丝腺的发育概况

5．家蚕Bmsage基因研究概况

6．反向遗传学技术

7．第二代高通量测序技术

8．研究目的及意义

9．主要内容

9．1 利用CRISPR／Cas9研究家蚕体壁等相关基因的功能

9．2 利用CRISPR／Cas9研究家蚕丝腺相关基因的功能

10．技术路线

第二章 利用CRISPR／Cas9研究家蚕体壁相关基因的功能

1．引言

2．实验材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3．实验结果

3．1 Bm-ok敲除结果

3．2 BmKMO、BmTH和Bmtan敲除结果

3．3 脱靶效应的检测

4．讨论

第三章 利用CRISPR／Cas9研究家蚕丝腺发育相关基因的功能

1．引言

2．实验材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3．实验结果

3．1 Bmsage靶点设计及确认

3．2 Bmsage突变率

3．3 Bmsage突变体表型的分析和筛选

3．4 Bmsage突变体化蛹期的生长情况

3．5 Bmsage突变体蛾子生长情况

3．6 Bmsage敲除的脱靶效应

4．讨论

第四章 家蚕Bmsage丝腺缺失突变体的RNA-seq分析

1．引言

2．实验材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3．实验结果

3．1 RNA-seq数据预处理

3．2 qRT-PCR验证结果

3．3 差异基因分析与筛选

3．4 差异基因的GO、KEGG信号通路分析

4．讨论

第五章 结论及后续研究展望

1．主要结论

2．创新点

3．后续研究展望

参考文献

1．攻读博士学位期间发表论文

2．参与课题

致谢