橘小实蝇CRISPR/Cas9技术及其在doublesex基因功能研究中的应用

摘要

橘小实蝇是一种危害严重的实蝇类害虫，CRISPR/Cas9技术作为近年来发展迅速的遗传改造新技术，在实蝇类害虫的防治中具有很大的应用前景。CRISPR/Cas9技术在果蝇、家蚕以及蚊类等昆虫中研究应用比较广泛，包括该技术的建立与优化、功能基因的探索、转基因品系的研究等;而在实蝇类昆虫中的研究则仅限于技术体系的建立，其相关应用鲜有报道。Doublesex(dsx)基因作为昆虫性别决定关键基因，在昆虫性别分化以及生殖中具有重要作用。本研究通过对CRISPR/Cas9系统靶标位点的筛选、比较分析Cas9mRNA/sgRNA和Cas9蛋白/sgRNA RNP复合体两种方法的敲除效率，我们建立了橘小实蝇CRISPR/Cas9技术体系，并以此为基础敲除橘小实蝇dsx基因，明确了dsx基因在橘小实蝇生殖发育中的作用。本研究有利于建立橘小实蝇在内的实蝇类害虫的CRISPR/Cas9技术与平台，并证明了dsx基因作为遗传改造的靶标基因在生物防治应用中的潜力，为橘小实蝇的遗传改造及绿色防控提供了理论和技术基础。
　　1.Bddsx基因克隆与分析
　　我们通过对Bddsx基因的克隆，补充了Bddsx基因组序列，增补的序列范围在NW_011876346.1:1203133-1203607(475bp)内。通过分析Bddsx与其近缘物种的进化关系，发现橘小实蝇dsx基因与橄榄果实蝇同源性最高，同源性高达98％。对Bddsx基因剪接模式分析，发现Bddsx基因有2个雄特异性区域和1个雌特异性区域，BddsxF以第3外显子进行跳跃式剪接;BddsxM在5'端以第2外显子进行跳跃式剪接，在3'端则以第3外显子5'端剪接方式进行剪接;同时还找到了与剪接识别相关的A5SS识别位点、PRE序列以及4个tra/tra-2结合位点。此外，Bddsx基因表达模式研究分析表明，BddsxF在雌成虫阶段高表达，在胸部、头部、肠道以及脂肪体等组织中表达较高;BddsxM则是在雄成虫阶段高表达，且在精巢中表达最高。
　　2.靶标位点设计与筛选
　　利用在线工具，我们在Bddsx基因的雌特异性区域设计了7个候选靶标位点，分别对其方向、靶标位置、sgRNA转录效率及切割效率进行了分析。在靶标位置方向上，位于正义链与反义链的靶标位点分别有4个（sg-f2、sg-f4、sg-f5和sg-f6）和3个（sg-f1、sg-f3和sgf7）;其sgRNA切割位点的位置顺序（距离）依次为sg-f1(+1)、sg-f3(+127)、sg-f4(+152)、sg-f2(+182)、sg-f5(+330)、sg-f6(+365)和sg-f7(+405)。对sgRNA转录效率分析结果表明:sg-f7转录效果最好，电泳条带灰度值为94.0;sg-f3次之，灰度值为81.9;其次为sg-f4，灰度值为42.3;sg-f1，sg-f2和sg-f5转录效果较差，灰度值分别为6.4，16.7和5.4;sg-f6没有成功转录。对sgRNA体外酶切活性检测结果表明:sg-f1和sg-f4切割效率最高，分别为74.3％和72.9％;sg-f3和sg-f5效率分别是28.9％和28.3％;sg-f7效率为15.1％;sg-f2没有检测到切割活性。综合考虑上述4个方面的因素，我们选择了sg-f4和sg-f7作为后续研究的靶标位点。
　　3.基于Cas9mRNA和蛋白的CRISPR/Cas9系统效率评估
　　通过对橘小实蝇胚胎注射Cas9mRNA/sgRNA和Cas9蛋白/sgRNA复合体，统计分析其存活率、突变个体比例，评估BddsxF基因删除效率以及sgRNA脱靶效应，研究比较Cas9mRNA/sgRNA和蛋白/sgRNA两种方法基因编辑的效率。结果表明:注射Cas9mRNA/sgRNA和Cas9蛋白/sgRNA的胚胎最终存活率分别是7.7％和2.0％;Cas9蛋白/sgRNA介导的基因片段删除效率高于Cas9mRNA/sgRNA(Student's t检验，P＜0.05)，平均删除效率分别为47.8％和28.1％;注射Cas9mRNA/sgRNA F0中突变个体占56.2％,注射Cas9蛋白/sgRNA F0中突变个体占67.7％。此外，通过对脱靶位点的检测分析，并没有发现明显地脱靶现象，说明在橘小实蝇中CRISPR/Cas9系统基因编辑特异性很高。综合考虑胚胎存活率、基因删除效率以及橘小实蝇突变个体比例，确定了Cas9mRNA/sgRNA是研究Bddsx基因的最适方法。
　　4.Bddsx基因功能研究
　　利用上述建立的橘小实蝇CRISPR/Cas9技术体系敲除BddsxF基因，研究Bddsx基因在生殖系统发育以及性特征维持中的作用，结果表明:BddsF基因敲除(dsxF-)后，橘小实蝇生殖力显著降低，dsxF-雌虫后代平均孵化率为5.9％,dsxF-雄虫后代平均孵化率则是28.2％;部分dsxF-个体（如M2）后代出现雄性化的倾向（雌雄比小于1∶1），但没有显著性差异(卡方测验，P(x2c＜x20.05，1=3.84)＞0.05）。与野生型相比，dsxF-蛹壳颜色较浅，少数雄虫腹部4～5节颜色加深，腹侧呈现黄色斑点;正常雌虫有2个大小相近的贮精囊，而dsxF-则出现2个以上，且比正常贮精囊小，贮精囊异常雌虫占雌虫总数的25.0％。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 Doublesex基因

1．1．1 Doublesex基因的发现

1．1．2 Doublesex基因的选择性剪接

1．1．3 Doublesex基因功能及其研究现状

1．2 CRISPR／Cas9技术原理及应用

1．2．1 CRISPR／Cas9技术原理

1．2．2 CRISPR／Cas9技术优缺点

1．2．3 CRISPR／Cas9技术方法

1．2．4 CRISPR／Cas9技术在昆虫中的应用

1．3 橘小实蝇的危害及其防治现状

1．4 研究内容和目的意义

1．4．1 研究内容和目的意义

1．4．2 拟采用的技术路线

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3 结果与分析

3．1 Bddsx基因克隆与分析

3．1．1 Bddsx基因系统进化分析

3．1．2 Bddsx基因蛋白序列分析

3．1．3 Bddsx基因克隆

3．1．4 Bddsx基因剪接模式与结构域分析

3．1．5 Bddsx基因表达模式分析

3．2 Bddsx sgRNA设计与筛选

3．2．1 sgRNA靶标位点设计

3．2．2 sgRNA转录效率评估

3．2．3 sgRNA活性检测

3．3 基于Cas9 mRNA和蛋白的橘小实蝇CRISPR／Cas9技术

3．3．1 Cas9 mRNA转录与RNP复合体制备

3．3．2 橘小实蝇胚胎显微注射

3．3．3 两种方法删除效率评估

3．3．4 橘小实蝇BddsxF基因敲除检测

3．3．5 脱靶效应评估

3．4 Bddsx基因功能研究

3．4．1 对橘小实蝇生殖力的影响

3．4．2 对橘小实蝇性比的影响

3．4．3 对橘小实蝇表型特征的影响

4 总结与展望

4．1 橘小实蝇CRISPR／Cas9技术

4．2 Bddsx基因及其功能研究

4．2．1 Bddsx基因的选择性剪接模式

4．2．2 Bddsx基因表达模式分析

4．2．3 Bddsx基因的功能

4．3 研究创新点

参考文献

致谢