两个二倍体棉种CDPK和FAD基因家族的全基因组鉴定与基因结构功能分析

摘要

棉花是我国重要的经济作物，棉纤维是天然纺织纤维最主要的来源，棉籽中含有丰富的脂肪和蛋白质，现在也被广泛用于加工生产成食用油、工业用油和动物饲料等。棉花是一种起源于热带和亚热带的喜温作物，它的栽培范围已经由热带和亚热带逐步扩展至较冷的区域，而温度低于15℃就会严重影响棉花的生长发育，导致种子萌发率降低、棉株易感病，最终造成大幅度减产。植物对外界环境压力的适应过程主要包括对压力信号的感知和随后的信号转导，最终引起各种生理生化反应和代谢反应的激活，使植物建立新的物质和能量代谢平衡，从而维持其在温度较低环境下稳定地生长。而在这些生理生化过程中，质膜变化占据极其重要的地位。细胞膜是植物与外界联系的界面，各种逆境对细胞的影响首先作用于质膜，而低温胁迫对膜系统不可逆伤害的原初反应发生在生物膜类脂分子的相变上。钙依赖蛋白激酶(CDPK)是一类仅依赖Ca2+而不依赖钙调素的蛋白激酶，参与调控多种信号转导途径，而膜结合脂肪酸脱氢酶(membrane-bound FAD)是一类不饱和脂肪酸合成途径的关键酶。这两类基因分别在低温环境胁迫下的信号转导和稳定质膜性质中起着非常重要的作用。本研究在二倍体棉种D基因组雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii）和A基因组亚洲棉（Gossypium arboreum）全基因组测序完成的基础上，对棉花CDPK和膜结合FAD基因家族在全基因组水平上进行了鉴定和综合比较分析，并探索其受低温胁迫过程中的应答反应。本研究主要内容包括：
　　⑴雷蒙德氏棉基因组CDPK基因家族的鉴定与低温胁迫应答分析。利用二倍体D组雷蒙德氏棉基因组数据，对其CDPK基因家族进行全基因组的鉴定与分析，结果表明:①雷蒙德氏棉基因组中有41个CDPK基因，分散分布在雷蒙德氏棉13条染色体上，分为四个不同的功能亚家族;②片段复制导致了雷蒙德氏棉CDPK基因数目的扩增，而且雷蒙德氏棉CDPK复制基因在进化过程中经历了强烈的纯化选择作用，基因功能的分化受到严重抑制;③绝大多数雷蒙德氏棉CDPK基因启动子区域含有低温应答元件，选定的11个雷蒙德氏棉CDPK基因在低温胁迫下，8个基因上调表达，说明CDPK基因在棉花低温胁迫响应反应中起着重要作用。
　　⑵亚洲棉基因组CDPK基因家族的鉴定与比较。利用雷蒙德氏棉和亚洲棉基因组数据，对两个棉种中CDPK基因家族进行综合比较，结果表明:①亚洲棉全基因组中共检索到43个CDPK基因，比雷蒙德氏棉基因组多2个CDPK基因，其中42个基因分散分布在12条染色体上，1个定位在还不能确定其染色体位置的scaffold序列上;②除了多出的2个CDPK基因，雷蒙德氏棉41个CDPK基因在亚洲棉基因组中均有对应的直系同源基因，而且它们的基因结构和蛋白质结构都非常保守;③大部分CDPK直系同源基因在不同组织以及低温诱导下的表达模式存在一定差异，说明CDPK直系同源基因在雷蒙德氏棉和亚洲棉中的表达已经开始分化，推测可能与雷蒙德氏棉和亚洲棉经过物种特异的进化后适应不同的生存环境有关。
　　⑶雷蒙德氏棉膜结合FAD基因家族的全基因组分析。对雷蒙德氏棉膜结合FAD基因家族进行全基因组分析，结果发现：雷蒙德氏棉基因组中共鉴定出19个膜结合FAD基因，定位在雷蒙德氏棉11条染色体上，进化分析将它们分为四个功能不同的亚家族；串联复制导致雷蒙德氏棉FAD2基因数目的扩增，而鞘脂类脱氢酶和Front-end脱氢酶亚家族的扩增是由片段复制引起的；雷蒙德氏棉GrFAD2.1推测可能是一个没有功能的假基因；组织特异性表达模式分析发现，GrFAD2.2、GrFAD3.1、GrFAD8.2和GrDSD2在胚珠中表达量最高，尤其是GrFAD2.2在胚珠中表达最为显著，在其它组织中表达量较低，可以作为基因工程技术改善棉籽油品质的候选基因；在低温诱导下，雷蒙德氏棉膜结合FAD基因中7个基因显著上调表达，而5个基因显著下调表达，说明膜结合FAD基因确实参与棉株对低温胁迫的应答反应。
　　⑷亚洲棉膜结合FAD基因家族的全基因组分析与比较。膜结合FAD基因家族在雷蒙德氏棉和亚洲棉基因组中的综合比较分析发现：亚洲棉全基因组中共检索到20个膜结合FAD基因，定位在12条染色体上，比雷蒙德氏棉基因组多两个FAD3基因，少一个FAD2基因；膜结合FAD基因家族在D基因组和A基因组中共发现18组直系同源基因，其中大部分直系同源基因基因结构和蛋白质结构是非常保守的；亚洲棉GaFAD3.2推测也可能是一个没有功能的假基因；雷蒙德氏棉GrFAD2.2和亚洲棉GaFAD2.1在胚珠中特异性表达，推测是棉仁组分中亚油酸含量最高的主要原因；亚洲棉GaFAD3.3和GaSLD1在纤维中特异性表达，说明它们在纤维快速伸长期可能起着重要的调控作用；雷蒙德氏棉和亚洲棉膜结合FAD基因大部分直系同源基因在不同组织以及低温诱导下的表达模式存在一定的差异，表明在进化过程中它们的功能已经开始分化。
　　⑸通过比较基因组学方法对两个二倍体棉种中的CDPK和膜结合FAD基因家族进行了综合研究，显示它们在棉属植物中发生了特异性扩增，在棉花低温胁迫下的应答反应中起着重要作用，且亚洲棉和雷蒙德氏棉大部分直系同源基因的功能已经开始分化。这些研究结果将为深入研究棉属植物低温胁迫下的响应机制、两个基因家族在棉属中的系统发育关系以及棉花种子品质遗传改良奠定了基础。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 文献综述

1．1 棉花简述

1．1．1 棉花的生产现状

1．1．2 棉花的分类

1．2 低温胁迫的研究进展

1．2．1 低温胁迫对植物影响

1．2．2 植物对低温胁迫的响应

1．2．3 低温胁迫相关基因的克隆

1．2．4 棉花低温胁迫抗性的研究进展

1．3 钙依赖蛋白激酶(CDPK)的研究进展

1．3．1 第二信使(Ca2+)

1．3．2 钙依赖蛋白激酶

1．4 脂肪酸脱氢酶(FAD)的研究进展

1．4．1 不饱和脂肪酸

1．4．2 脂肪酸脱氢酶

1．5 比较基因组学和基因家族的进化

1．5．1 比较基因组学

1．5．2 植物基因组测序进展

1．5．3 基因家族及基因家族的扩增

1．5．4 基因家族发生复制后功能的分化

1．6 本研究的目的意义

第二章 雷蒙德氏棉CDPK基因家族的鉴定和基因结构功能分析

2．1 材料与方法

2．1．1 雷蒙德氏棉中CDPK基因的检索

2．1．2 进化分析和基因结构预测

2．1．3 染色体定位和基因复制分析

2．1．4 复制基因对Ka／Ks估算

2．1．5 低温胁迫相关顺式作用元件分析

2．1．6 雷蒙德氏棉的种植、低温处理及胚珠取样

2．1．7 RNA提取和荧光定量PCR

2．2 结果与分析

2．2．1 雷蒙德氏棉CDPK基因的鉴定与注释

2．2．2 CDPK基因家族的进化分析

2．2．3 雷蒙德氏棉CDPK基因的染色体定位和基因结构分析

2．2．4 CDPK基因复制事件和功能分化

2．2．5 雷蒙德氏棉CDPK基因的表达模式分析

2．3 讨论

2．4 结论

第三章 亚洲棉CDPK基因家族的鉴定与基因结构功能分析

3．1 材料与方法

3．1．1 亚洲棉中CDPK基因的检索

3．1．2 序列比对和进化树构建

3．1．3 染色体定位和基因结构分析

3．1．4 亚洲棉的种植及低温处理

3．1．5 亚洲棉胚珠及纤维取样

3．1．6 RNA提取和荧光定量PCR

3．2 结果与分析

3．2．1 亚洲棉CDPK基因的鉴定与注释

3．2．2 亚洲棉CDPK基因的进化

3．2．3 亚洲棉CDPK基因的染色体定位

3．2．4 亚洲棉CDPK基因的基因结构分析

3．2．5 CDPK基因在不同组织中的表达模式分析

3．2．6 CDPK基因在低温诱导下的表达模式分析

3．3 讨论

3．4 结论

第四章 雷蒙德氏棉膜结合FAD基因家族的鉴定与基因结构功能分析

4．1 材料与方法

4．1．1 雷蒙德氏棉中膜结合FAD基因的检索

4．1．2 进化树构建和基因结构分析

4．1．3 染色体定位和基因复制分析

4．1．4 雷蒙德氏棉的种植、低温处理及胚珠取样

4．1．5 RNA提取和荧光定量PCR

4．2 结果与分析

4．2．1 雷蒙德氏棉膜结合FAD基因的鉴定与注释

4．2．2 膜结合FAD基因家族的进化分析

4．2．3 膜结合FAD基因的保守结构域分析

4．2．3 膜结合FAD基因的保守结构域分析

4．2．4 膜结合FAD基因染色体定位和基因结构分析

4．2．5 膜结合FAD基因在不同组织中的表达模式分析

4．2．6 膜结合FAD基因在低温诱导下的表达模式分析

4．3 讨论

4．4 结论

第五章 亚洲棉膜结合FAD基因家族的鉴定与基因结构功能分析

5．1 材料与方法

5．1．1 亚洲棉中膜结合FAD基因的检索

5．1．2 序列比对和进化树构楚

5．1．3 染色体定位分析

5．1．4 基因结构分析

5．1．5 亚洲棉的种植及低温处理

5．1．6 亚洲棉胚珠及纤维取样

5．1．7 亚洲棉和雷蒙德氏棉成熟棉仁脂肪酸测定

5．1．8 RNA提取和荧光定量PCR

5．2 结果与分析

5．2．1 亚洲棉膜结合FAD基因的鉴定与注释

5．2．2 亚洲棉膜结合FAD基因的进化

5．2．3 亚洲棉膜结合FAD基因的染色体定位

5．2．4 亚洲棉膜结合FAD基因的基因结构和保守结构域分析

5．2．5 膜结合FAD基因在不同组织中的表达模式分析

5．2．6 膜结合FAD基因在低温诱导下的表达模式分析

5．2．7 亚洲棉和雷蒙德氏棉不同脂肪酸含量测定

5．3 讨论

5．4 结论

第六章 全文总结与展望

参考文献

附录

攻读博士学位期间所发表论文