菌龄对核盘菌致病性的影响及植物抗核盘菌分子机制

摘要

核盘菌(sclerotinia sclerotiorum)是一种在世界范围内广泛分布的死体营养型病原真菌。核盘菌引起的菌核病是油料和蔬菜作物的重要病害。草酸和细胞壁降解酶是核盘菌重要致病因子。核盘菌生长过程中当遇到不利条件时会产生气生菌丝并形成菌核，核盘菌菌丝形态的分化使其致病力发生很大变化。但具体机制尚不清楚。目前对植物抗核盘菌机制的理解仍很肤浅，抗核盘菌调控新基因的鉴定急需开展，作为核盘菌的非寄主植物的水稻与核盘菌的互作或许会为核盘菌抗性研究提供新的发现。本研究围绕植物与核盘菌的互作机理，解析菌龄影响核盘菌致病力的分子机制、阐明植物钙离子信号通路在抗核盘菌中的作用、采用本氏烟cDNA文库-VIGS筛选技术，获取抗核盘菌调控新基因，并初步揭示水稻与核盘菌的非寄主互作分子机制，获得了如下结果:
　　(1)明确了核盘菌菌丝形态分化与致病力的关系，解释了富含气生菌丝的老熟菌丝致病力下降的原因。核盘菌平板培养时老熟菌丝上会有大量气生菌丝产生，显微观察发现气生菌丝直径明显比幼嫩菌丝小，只有幼嫩菌丝的1/5左右。与新生菌丝（菌龄为0d的幼嫩菌丝)相比，1 d-3d菌龄的老熟菌丝致病力明显下降。进一步分析显示，老熟菌丝中草酸合成关键基因OAH的表达明显低于幼嫩菌丝，而且老熟菌丝产草酸的能力显著下降。外源施加草酸(10 mM，pH7.0)部分恢复老熟菌丝的致病力。这些结果证明草酸分泌的降低导致了老熟菌丝致病力的下降。此外，1 d-3d老熟菌丝中超氧阴离子和过氧化氢含量低于0d菌龄的菌丝，这与活性氧代谢相关基因的表达结果相对应。另外，RNAi分析结果表明，微管相关蛋白EB1基因的沉默减弱生长发育和菌核形成，致病力也明显下降。显示EB1基因在核盘菌生长发育、菌核形成和致病性中的重要作用。
　　(2)揭示了钙离子信号途径和AtWRKY11基因在植物抗核盘菌中的作用。采用芯片表达谱技术比较分析了接种核盘菌前后油菜叶片的基因表达谱，发现有1072个差异表达在2倍以上的基因，其中接种后上调表达基因531个，下调表达基因541个。差异表达基因中有15个与钙离子信号通路相关。药理学研究结果显示，钙离子通道抑制剂氯化镧(LaCl3，1 mmol/L)和钙泵抑制剂偏钒酸钠(NaVO3，50μmol/L)处理降低了本氏烟对核盘菌的抗性，而CaCl2(10 mmol/L)处理则增强该抗性。这些调节剂的处理显著诱导包括AtWRKY11在内的一组钙离子信号传导基因的表达。拟南芥wrky11突变体对核盘菌抗性显著下降。这些结果证明了钙离子信号通路对植物抗核盘菌起重要调控作用。
　　(3)在基因组水平鉴定了番茄钙离子依赖的蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinase，CDPK)和CDPK-related protein kinase(CRK)基因家族，并采用病毒诱导的基因沉默(Virusinduced gene silencing，VIGS)技术分析明确了SlCDPK和SlCRK基因对核盘菌抗性的重要调控作用。采用生物信息学方法鉴定了29个番茄CDPK基因和6个CRK基因。所有SlCDPK蛋白都包含一个STKc CAMK类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域和两个EF-hand类钙离子结合结构域，所有SlCRK仅仅在N端包含一个STKc_CAMK类的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域，而C端不含有保守的Ca2+结合位点。系统进化分析发现番茄CDPK家族分为4个组。其中第Ⅳ组SlCDPKs比较特殊，它们是碱性蛋白并有11个内含子。VIGS分析显示，SlCRK6同时参与了对核盘菌和Psedomonas syringae pv.tomato DC3000(Pst DC3000)的抗性调控;而SlCDPK10和SlCDPK18基因对核盘菌抗性没有显著调控作用，但分别正调控对Pst DC3000和Xanthomonas oryzae pv.oryzae(Xoo)的抗性。这些结果说明，SlCDPK和SlCRK广泛参与对各种病害抗性的调控，且不同抗性有不同的基因参与。另外，酵母双杂交分析结果表明，SlCDPK12与SlCaML蛋白互作。
　　(4)采用本氏烟cDNA文库VIGS筛选方法，筛选鉴定了一批草酸耐性和核盘菌抗性调控基因。从构建的文库中挑取了511个基因进行VIGS分析，一共筛选获取了71个草酸耐性调控基因和63个核盘菌抗性调控基因，其中，Upstream activation factor subunitUAF30(编号437)和Translationally-controlled tumor protein(编号502)等基因的沉默植株对草酸耐受力减弱，对核盘菌的抗性也减弱，而Aspartic proteinase oryzasin-1(编号135)等基因的沉默植株对草酸的耐受力增强，对核盘菌抗性也增强。说明这些基因对草酸介导的植物与核盘菌互作起重要调控作用。有些基因只涉及对草酸耐性或核盘菌抗性的调控，说明植物对核盘菌的抗性除了草酸外还有别的途径。
　　(5)建立了水稻与核盘菌的非寄主抗性互作体系，初步明确了该非寄主互作的调控机制。核盘菌野生型1980菌株接种24 h后水稻叶片产生肉眼可见的类似HR反应的褐色坏死小斑点。褐色斑点内有大量活性氧积累，核盘菌被限制在坏死区域无法扩展。而不致病的PB菌株接种后水稻叶片没有产生类似反应。利用TMT标记方法对接种核盘菌的水稻叶片蛋白表达进行定量分析。对接种野生型1980菌株与不致病的PB菌株之间、以及PB菌株接种与不接种之间的水稻叶片差异表达蛋白分析结果表明，以下蛋白可能参与对核盘菌抗性的调控:P-protein; Proline-rich-like protein; ribonuclease T2 family protein; Eukaryotictranslation initiation factor3;RALFL4(Rapid ALkalinization Factor RALF family protein);lrgB-like family protein和CHIT14(Chitinase family protein)以及一组氧化还原调节蛋白。其中RALFL4具有碱化作用，而CHIT14能够降解真菌细胞壁几丁质。该结果揭示维持酸性环境是非寄主抗性产生所必需。此外，差异表达的Eukaryotic translation initiation factor3为泛素化蛋白。说明泛素化参与对核盘菌抗性的调控。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 文献综述

1．1 引言

1．2 核盘菌与植物菌核病

1．2．1 核盘菌及其生物学特性

1．2．2 植物菌核病

1．3 核盘菌侵染植物的过程及方式

1．4 核盘菌与植物互作机理研究进展

1．4．1 核盘菌致病因子鉴定及致病机理研究进展

1．4．2 植物抗核盘菌机理研究进展

1．5 植物钙离子信号通路及CDPK和CPK基因家族在抗病中的研究进展

1．5．1 植物钙离子信号通路在抗病中的研究进展

1．5．2 植物CDPK和CRK基因家族在抗病中的研究进展

1．6 植物非寄主抗性研究进展

1．7 本研究的目的意义及内容

第二章 核盘菌不同菌龄菌丝的形态分化对其致病力的影响

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．2．1 材料

2．2．2 方法

2．3 结果与分析

2．3．1 不同菌龄核盘菌菌丝致病力存在显著差异

2．3．2 草酸(OA)在不同菌龄菌丝中含量差异及其对致病力的影响

2．3．3 不同菌龄核盘首菌丝内ROS含量变化及相关基因表达差异

2．3．4 不同菌龄菌丝差异表达蛋白基因表达检测

2．3．5 不同菌龄菌丝差异表达蛋白基因EB1的RNAi功能分析

2．3．6 核盘菌不同菌龄菌丝组成和形态差异的显微观察

2．4 讨论

第三章 钙离子信号途径和AtWRKY11基因在植物抗核盘菌中的作用分析

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 材料

3．2．2 方法

3．3 结果与分析

3．3．1 油菜接种核盘菌后的基因表达谱分析揭示许多钙离子信号通路基因在核盘菌接种前后显著差异表达的表达谱分析

3．3．2 钙离子信号通路在植物抗核盘菌中的药理学分析

3．3．3 核盘菌接种改变了拟南芥钙离子信号途径相关基因的表达

3．3．4 钙离子信号通路相关基因wrky11在拟南芥与核盘菌互作中的作用

3．4 讨论

第四章 番茄CDPK和CRK基因家族鉴定及其抗病功能分析

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．2．1 材料

4．2．2 方法

4．3 结果与分析

4．3．1 番茄CDPK和CRK基因家族的鉴定与分析

4．3．2 SlCDPK与SlCRK基因的抗病调控功能的VIGS分

4．3．3 SlCDPK和SlCRK与SlRboh2和SlCaM互作的酵母双杂交分析

4．4 讨论

第五章 本氏烟抗核盘菌调控基因的文库基因沉默初筛

5．1 前言

5．2 材料与方法

5．2．1 材料

5．2．2 方法

5．3 结果与分析

5．3．1 基因沉默植株对草酸耐受力和核盘菌的抗性检测

5．3．2 参与本氏烟与核盘菌互作的部分基因的鉴定

5．4 讨论

第六章 核盘菌与水稻的非寄主抗性互作体系的建立

6．1 前言

6．2 材料与方法

6．2．1 材料

6．2．2 方法

6．2．3 数据分析

6．3 结果与分析

6．3．1 水稻接种核盘菌后的症状观察

6．3．2 接种核盘菌后水稻ROS产生情况检测

6．3．3 接种核盘菌后水稻HR坏死的台盼蓝染色检测

6．3．4 核盘菌菌株1980和PB接种后水稻叶片蛋白表达的比较分析

6．4 讨论

第七章 全文小结

参考文献

附表

附录 作者攻读博士期间发表论文情况