四氢呋喃(THF)降解菌株Rhodococcus sp.YYL的代谢组、定殖及与Bacillus cereus HZX互作关系研究

摘要

四氢呋喃(THF)具有广泛用途，同时也是一种持久性环境污染物。微生物降解是去除四氢呋喃污染的最有效手段之一。本论文围绕四氢呋喃降解菌株Rhodococcus sp.YYL进行研究，评价了THF对菌株YYL基础代谢的影响，开展了海藻糖对菌株YYL降解THF及生物强化定殖的影响研究，阐明了非THF降解菌株Bacillus cereus HZX和菌株YYL在降解THF时的互作关系，所获结果分述如下:
　　(1)利用核磁共振(NMR)代谢组学方法研究菌株YYL响应THF时代谢组变化。结果显示菌株YYL在利用酵母膏作为碳源时，THF胁迫对菌株YYL的代谢物几乎没有影响;THF降解过程中，菌株YYL生理代谢发生动态变化，主要是积累海藻糖、加快三羧酸循环(TCA)中从琥珀酸到苹果酸的转化速率和加速蛋白质与核苷酸合成等生理代谢，为更好地发挥THF降解性能。
　　菌株YYL胞内海藻糖积累量与菌株YYL降解THF速率正相关。2mM海藻糖添加到菌株YYL降解THF的培养基中后，结果表明在初始pH7.0时，相对于菌株YYL在较适生长初始pH8.26，菌体细胞需要外源海藻糖起保护剂的作用，体现在2 mM海藻糖能提高THF单加氧酶基因(thm)的转录表达、琥珀酸脱氢酶(SDH)活力、ATPase酶活力、丙酮酸激酶(PK)活力、总超氧化物歧化酶(T-SOD)活力及谷胱甘肽(GSH)含量。
　　(2)海藻糖作为生物刺激物应用于菌株YYL生物强化过程中，2 mM海藻糖能帮助菌株YYL更好地定殖于THF处理反应器中，使THF降解效率更高，使高浓度THF对反应器微生物菌群的胁迫影响降低，具体表现为:活性污泥菌群丰度提高，多样性更加丰富，菌群活性增强，胞外多聚物(EPS)含量增多，活性污泥沉降性能改善。
　　可溶性单铁单加氧酶(SDIMOs)是一种重要的多组分酶，存在于许多菌株中，主要负责碳氢类化合物初始氧化步骤。细胞色素P450氧化酶(P450s)是一种通用性多功能酶，主要负责非活性碳氢化合物的氧化。通过PCR-DGGE、克隆文库及qPCR技术研究上述两个酶的编码基因多样性及丰度。结果表明THF废水处理反应器中，添加2mM海藻糖能帮助基因SDIMO、CYP153保存更高的多样性及丰度，推测适量海藻糖可以增强拥有上述两个基因的菌株环境适应性。
　　生物修复时，有机物降解势必会影响系统中的生物脱氮效率。2 mM海藻糖对于氮循环（硝化与反硝化）功能菌的影响呈现差异化:对于氨氧化细菌(AOB)，添加2 mM海藻糖利于其维持更高多样性，加快氨氮转化;对于反硝化功能菌，添加2 mM海藻糖利于编码Cu亚基的亚硝酸还原酶基因(nirK)保存更高多样性和丰度，但降低了编码细胞色素cd1亚基的亚硝酸还原酶基因(nirS)和一氧化二氮还原酶基因(nosZ)的多样性和丰度。
　　(3) THF降解菌株YYL与非降解菌株Bacillus cereus HZX的互作关系研究中，互作结果主要取决于菌株YYL所处环境pH，在菌株YYL降解THF最适pH8.26时，菌株YYL能高效降解THF;不利pH7.0条件下，菌株YYL与HZX以1∶0.5混合时，菌株YYL降解基因thm转录表达活性增强，THF降解效率更高，培养基pH值下降更明显，混合菌中的菌株HZX比例升高。
　　菌株YYL和菌株HZX在按1∶0.5比例混合时，使用转录组学方法分析菌株间互作机制。相对于初始pH8.26，初始pH7.0培养下菌株YYL更加需要菌株HZX的帮助。初始pH7.0时，菌株HZX通过利用从菌株YYL降解THF过程中代谢产物而存活，作为回报，菌株HZX通过增强某些基因表达帮助菌株YYL行使一些基础代谢功能，例如合成氨基酸、进行糖转化、合成2-氧代羧酸及合成不饱和脂肪酸亚油酸等。互作使菌株YYL发挥更高的THF降解效率。

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摘要

第一章 文献综述

1．四氢呋哺降解菌及降解途径的研究

1．1 四氢呋喃降解菌的分离与种类

1．2 四氢呋喃降解途径的研究进展

1．3 四氢呋喃单加氧酶及其基因研究进展

2．基础代谢组学在微生物研究中的运用

2．1 代谢组学研究微生物响应环境压力

2．2 代谢组学研究微生物基因功能

2．3 代谢组学在发酵工艺的监控和优化中的运用

2．4 代谢组学在环境微生物领域的运用

2．5 展望

3．海藻糖在细胞应对逆境胁迫响应与适应中的作用机制

3．1 微生物细胞内海藻糖的积累机制

3．2 海藻糖保护微生物细胞的作用机制

3．3 展望

4．生物强化中的微生物定殖研究

4．1 与生物刺激法联合

4．2 利用生物载体将强化微生物固定化

4．3 投加与降解菌产生共聚效应的菌株

5．微生物在生物降解过程中的互作关系研究

5．1 互作模式的类型

5．2 展望

6．研究的目的、意义及主要内容

6．1 研究的目的和意义

6．2 研究的主要内容

第二章 四氢呋喃下Rhodococcus sp．YYL的代谢组研究

第—节 Rhodococcus sp．YYL代谢网络变化研究

1．材料与方法

2．结果与分析

3．小结与讨论

第二节 海藻糖对Rhodococcus sp．YYL降解THF性能的影响研究

1．材料与方法

2．结果与分析

3．小结与讨论

第三章 海藻糖在处理四氢呋喃废水系统中的生态效应

第一节 细菌总群落结构变化研究及胞外多糖成分分析

1．材料与方法

2．结果与分析

3．小结与讨论

第二节 可溶性单铁单加氧酶基因(SDIMO)及细胞色素P450氧化酶基因(CYP153)多样性分析

1．材料与方法

2．结果与分析

3．小结与讨论

第三节 参与氮循环细菌菌群结构变化研究

1．材料与方法

2．结果与分析

3．小结与讨论

第四章 THF降解菌Rhodococcus sp．YYL与非降解菌Bacillus HZX的互作关系研究

第一节 THF降解菌Rhodococcus sp．YYL与非降解菌Bacillus HZX共培养中的相互影响

1．材料与方法

2．结果与分析

3．小结与讨论

第二节 单独培养与共培养中的宏转录组学比较分析

1．材料与方法

2．结果与分析

3．小结与讨论

第五章 论文总结

1．论文的主要研究结论

2．论文的创新之处

3．论文的不足与展望

参考文献

攻读博士学位期间研究成果与个人荣誉