基于反转录转座子标记的梨属植物亲缘关系研究

摘要

梨属（Pyrus L.）植物自然分布于欧亚大陆，根据地理分布梨属植物可以分为东西方梨两大种群。梨属种间不存在生殖隔离，种内和种间杂交情况比较普遍，给梨属分类带来了一定的困难。传统的AFLP、SSR、核基因和叶绿体序列并不能很好地解决梨属植物的系统发育问题。随着梨全基因组测序的完成，基因组序列为梨属植物系统发育、亲缘关系和进化研究提供了新的手段。梨基因组中42.4％为反转录转座子，反转录转座子具有良好的插入多态性。本研究对梨基因组中反转录转座子进行了预测并开发了基于反转录转座子的多种标记。利用这些标记对梨属植物进行了亲缘关系研究和进化分析。本研究主要内容包括：
　　⑴使用生物信息学方法对梨的Ty1-copia和Ty3-gypsy类型反转录转座子进行了预测，共获得1，836条LTR反转录转座子。通过聚类分析分离出10个拷贝数丰富的反转录转座子家族。为了深入了解反转录转座子特性，本研究对反转录转座子中关键元件逆转录酶序列进行了分离，共获得345条copia类型逆转录酶序列和99条gypsy类型逆转录酶序列。酥梨中逆转录酶氨基酸序列显示出高度异质性。通过检索转录组数据及半定量实验证明梨属植物正常生长的器官中逆转录酶是活跃的。
　　⑵使用反转录转座子LTR区域及其基因组侧翼序列开发RBIP（Retrotransposon-based Insertion Polymorphisms）标记，共开发了192对RBIP引物。使用其中的24对引物对110个梨属植物进行了分析。结果显示RBIP标记具有非常好的多态性。STRUCTURE结果和聚类树均显示梨属可以分为2个种群，即为东方梨和西方梨。进一步可以将东方梨区分为野生梨和栽培梨。但栽培种中砂梨、白梨和秋子梨品种聚类混乱。‘蒲瓜梨’和‘雁荡雪梨’这两个砂梨品种在聚类图中显示100％的相似度，被鉴定为同物异名。
　　⑶由于RBIP标记提供的信息位点少，东方梨内部聚类依旧混乱。基于此本研究开发了另一种基于反转录转座子的SSAP(Sequence-Specific Amplification Polymorphisms)标记。使用12对SSAP标记对亚洲梨属植物进行了分析。结果显示12对引物组合共扩增得到2833个条带，多态性条带比例为98.8％。使用STRUCTURE软件对亚洲梨群体结构进行分析，结果显示亚洲梨起源于5个基因库，其中4个基因库来源于川梨、杜梨、秋子梨和砂梨，另一个基因库来源于西方梨。在不同的梨属种中，大部分个体由多个基因库组成，说明梨属内部杂交事件频发。基于此，亚洲梨属植物可以分为4个原种，分别为川梨、杜梨、秋子梨和砂梨，其余种均为自然杂交种。豆梨可能为川梨和杜梨的自然杂交种。新疆梨为东西方梨杂交种。木梨起源比较复杂，它可能被混入了川梨、秋子梨和西洋梨的血统。河北梨极有可能为秋子梨和杜梨的杂交种，褐梨是砂梨或秋子梨与杜梨的杂交种，日本青梨为秋子梨和日本豆梨的杂交种。
　　⑷SSAP标记结果显示东方梨系统内白梨和砂梨的基因库组成是一致的，说明它们之间的遗传背景相同，且在聚类过程中2者不能单独聚类。所以本研究支持白梨作为砂梨的一个生态型，而非一个独立的种的观点。从亚洲梨地域分布来看，北方的白梨大多混入了秋子梨血统，而南方的砂梨大多混入了川梨血统。STRUCTURE结果显示日本梨和白梨、中国砂梨拥有类似的基因库，但聚类树显示日本梨与中国沿海部分砂梨单独聚类。可能的原因是砂梨传入日本后，由于日本与中国的地理隔离，阻断了与原来的砂梨的遗传交流，使其逐渐演变为有别于大陆砂梨的日本梨。秋子梨品种中含有砂梨（白梨）血统，极有可能是白梨与野生秋子梨的杂交种。这些杂交事件的发生是亚洲梨属植物分类混乱的主要原因。

目录

声明

致谢

摘要

缩略语表

1 绪论

1．1 梨属植物系统发育、亲缘关系与起源研究进展

1．1．1 梨属植物起源和地理分布

1．1．2 梨属植物的基本种及形态分类

1．1．3 梨属品种演化

1．1．4 基于DNA分子标记和序列的梨属植物系统发育与亲缘关系研究

1．2 反转录转座子研究进展

1．2．1 植物反转录转座子类型

1．2．2 植物反转录转座子的结构特征

1．2．3 LTR反转录转座子的活性及影响因素

1．2．4 基于反转录转座子的标记开发及利用

1．3 立题依据与研究内容

2 梨反转录转座子预测及功能元件分析

2．1 材料与方法

2．1．1 试验材料

2．1．2 反转录转座子预测

2．1．3 反转录转座子插入时间分析

2．1．4 反转录转座子侧翼区域基因分析

2．1．5 梨反转录转座子转录分析

2．1．6 反转录转座子内部元件预测及分析

2．1．7 逆转录酶半定量分析

2．2 结果与分析

2．2．1 梨反转录转座子预测

2．2．2 梨反转录转座子的分类

2．2．3 梨属植物中反转录转座子插入时间

2．2．4 梨属植物中反转录转座子转录分析

2．2．5 梨属植物中反转录转座子侧翼区域基因注释

2．2．6 反转录转座子逆转录酶预测

2．2．7 逆转录酶的系统进化分析

2．2．8 不同支系逆转录酶序列分析

2．2．9 梨属植物中逆转录酶PCR扩增及半定量分析

2．3 讨论

2．3．1 梨反转录转座子预测

2．3．2 梨反转录转座子插入时间预测

2．3．3 逆转录酶进化分析

2．3．4 反转录转座子转录分析

3 RBIP标记开发及其在梨属植物亲缘关系研究中的应用

3．1 材料与方法

3．1．1 试验材料

3．1．2 RBIP标记开发

3．1．3 PCR扩增和结果分析

3．1．4 数据处理

3．2 结果与分析

3．2．1 梨样品DNA提取与检测

3．2．2 RBIP标记开发

3．2．3 RBIP标记在梨属种中扩增

3．2．4 梨属亲缘关系研究

3．3 讨论

3．3．1 反转录转座子分布和RBIP标记特征

3．3．2 梨属亲缘关系

3．3．3 杂种起源

3．3．4 梨属同物异名鉴定

4 SSAP标记开发及其在亚洲梨亲缘关系及品种起源研究上的应用

4．1 材料与方法

4．1．1 试验材料

4．1．2 标记开发

4．1．3 双酶切反应

4．1．4 连接

4．1．5 预扩增

4．1．6 选择性扩增

4．1．7 数据处理

4．2 结果与分析

4．2．1 SSAP标记多态性

4．2．2 亚洲梨基因库组成

4．2．3 亚洲梨基因库地理分布

4．2．4 亚洲梨亲缘关系

4．3 讨论

4．3．1 SSAP标记特征

4．3．2 亚洲梨基本种

4．3．3 亚洲梨种间杂交事件

4．3．4 亚洲梨种群中的自然杂交种

4．3．5 川梨起源与迁移

5 结论与展望

5．1 结论

5．1．1 梨属反转录转座子

5．1．2 逆转录酶

5．1．3 梨属植物亲缘关系和品种分化

5．2 展望

5．2．1 梨属植物分类

5．2．2 亚洲可疑杂交种的起源与品种演化研究

5．2．3 梨属反转录转座子研究

参考文献

附表

作者简历