猪瘟病毒石门株和疫苗C株嵌合病毒构建及其特性鉴定

摘要

猪瘟是猪的重要传染病，具有致死性及高度传染性等特点，其病原为猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)，为黄病毒科瘟病毒属成员，是有囊膜的单股正链RNA病毒。CSFV基因组长约12.3kb，基因组两端为非编码区，编码区为一个11697bp的开放性阅读框，编码长度为3898个氨基酸的多聚前体蛋白，在宿主细胞蛋白酶的作用下逐步裂解为8种非结构蛋白和4种结构蛋白，基因组内的顺序依次为Npro、Core、Erns、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B，其中Core、Erns、E1和E2为结构蛋白。对CSFV主要蛋白的功能研究已较为深入，在病毒复制及其与宿主细胞互作研究方面也取得了进展，这些研究成果得益于感染性克隆技术发展。
　　以疫苗C株作为骨架进行新型猪瘟标记疫苗的开发是一大研究热点，但相对于强毒株，C株病毒本身在体外培养细胞中的生长较慢。我们发现以C株感染性克隆为基础拯救的重组病毒滴度较低，可能与其细胞适应性差有关。本研究拟在C株和强毒株石门株感染性克隆的基础上，通过对两个毒株不同蛋白区段进行相互置换，构建一系列重组嵌合病毒，以研究结构蛋白及非结构蛋白对猪瘟病毒细胞适应性的影响，解析影响猪瘟病毒在ST细胞和PK-15细胞中复制的重要蛋白，为从基因水平上对疫苗C株进行改造提供依据，也为进一步探索猪瘟病毒体外复制和组装机制奠定基础。
　　1.重组C株高低代次毒株与石门株体外增殖能力差异比较
　　在相同感染比条件下，无论是高代次还是低代次重组C株病毒(RecCpp40和RecCpp80)在细胞内的增殖能力均弱于石门株，但三株病毒感染过程中基因组复制水平差异不明显(P＞0.05)。感染后96h RecCpp80的子代病毒数量是RecCpp40的30倍以上(P＜0.01);感染后96h细胞外病毒粒子数比较结果显示，胞内病毒增殖能力与释放到胞外的病毒量成正比，石门株胞内增殖能力强，释放到胞外的病毒粒子数也显著高于重组C株病毒(P＜0.05);石门毒株C株细胞间的扩散能力显著优于RecCpp80，特别是在覆盖琼脂糖的情况下，石门毒株的扩散能力受琼脂培养基的影响较小，在两种培养条件下均能形成大而弥散的病毒斑。因此，我们推测C株与石门株之间的细胞适应性差异主要与病毒在细胞内的增殖能力及其细胞间扩散能力相关。
　　2.猪瘟病毒C株与石门株嵌合病毒构楚及其细胞内增殖能力和兔体反应比较
　　为了解析不同毒株体外增殖能力差异的分子基础，我们构建了石门株的感染性克隆，并以疫苗C株和石门株感染性克隆为基础构建了猪瘟病毒结构蛋白和非结构蛋白编码基因互换的感染性克隆，并成功拯救了石门株重组病毒和11个重组嵌合猪瘟病毒。体外生长特性比较结果显示，疫苗C株和石门株半长基因组的相互置换可提高C株病毒的体外增殖能力，其中置换有石门株非结构蛋白至非编码区半长的嵌合毒株与C株重组病毒RecCpp80相似。置换石门毒株NS2-NS4B的重组嵌合C株病毒体外增殖能力显著提高，而置换有C株NS2-NS4B区段嵌合石门毒株的体外增殖能力低于亲本石门重组病毒，说明非结构蛋白NS2-NS4B区段对猪瘟病毒的体外增殖具有重要作用。置换石门毒株NS4A-3-UTR片段或NS5A-3-UTR，不增强C株嵌合病毒的体外增殖能力。为了评价基因置换对疫苗C株兔体适应性的影响，将嵌合毒株进行了兔体接种实验。结果显示，分别含有C株前半长（结构蛋白）或后半长（非结构蛋白）基因的嵌合毒株均能够引起兔定型热反应，含有石门毒株NS2-NS4B基因区段的嵌合C株病毒亦能引起兔体温升高反应，但置换C株NS4A-3-UTR和NS2-NS4B区段的嵌合石门毒株则不诱导兔体发热反应。以上结果说明C株的两端非编码区以及结构蛋白区域与兔体适应性密切相关。
　　3.猪瘟病毒NS2跨膜区在病毒增殖中的作用
　　为了初步解析NS2蛋白在猪瘟病毒增殖中的作用，对NS2的N端6个跨膜结构(Transmembrane，TM)序列分别进行了PCR扩增后，构建了12个含有NS2不同区段融合表达GFP的真核表达重组质粒，转染ST细胞后比较了不同跨膜区融合蛋白的亚细胞定位。结果表明，NS2蛋白N端不同区段的跨膜结构均能在定位于内质网中，在细胞内呈现网状分布。以石门株感染性克隆为模板，对NS2的N端6段潜在跨膜结构进行单段缺失，或通过在跨膜区核心序列中央插入丙氨酸改变跨膜区构象，成功构建12个NS2不同突变的感染性克隆，体外转录RNA电转ST细胞以拯救重组病毒。结果显示，缺失任何一段NS2跨膜结构均导致病毒复制缺陷，不能产生子代病毒。在TM1正中插入丙氨酸后不影响子代病毒复制和组装，在TM3和TM6中相应的插入则导致病毒产生时间延后，在3-4代连续传代才能获得重组病毒;而在TM2，4，5中分别插入突变后，病毒RNA在细胞内呈低水平复制，且不产生重组病毒。上述结果说明NS2的跨膜区在猪瘟病毒复制和组装过程中具有重要作用，但作用的具体机制需要进一步研究。
　　综上所述，我们以猪瘟病毒C株与石门株之间在体外培养细胞适应性差异为切入点，通过结构蛋白和非结构蛋白基因置换以及NS2蛋白跨膜区的缺失或丙氨酸插入，探明了非结构蛋白NS2-NS4B区以及NS2跨膜区对猪瘟病毒的增殖具有重要作用，疫苗C株基因组两端的非编码区以及结构蛋白区域介导兔体发热反应。研究结果为深入探索猪瘟病毒的增殖机制和猪瘟疫苗C株的改良奠定了良好基础。

目录

声明

摘要

第一部分 文献综述

1 猪瘟简介

2 猪瘟感染的临床症状

3 猪瘟病毒分子生物学特性

3．1 猪瘟病毒基因组结构

3．2 不同病毒蛋白的结构和功能

4 猪瘟病毒的分型及分子流行病学研究

5 猪瘟病毒的细胞培养与复制

5．1 培养特性

5．2 猪瘟病毒的复制

5．3 非结构蛋白在猪瘟复制中的作用

6 反向遗传操作系统与猪瘟病毒研究

6．1 反向遗传操作系统与感染性克隆

6．2 猪瘟病毒感染性克隆研究进展

7 猪瘟兔化弱毒疫苗C株概述

7．1 弱毒疫苗及C株疫苗免疫特点

7．2 C株疫苗生产方法

8 本研究的目的和意义

第二部分 试验研究

第一章 猪瘟病毒C株与石门毒株体外生长特性比较

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第二章 猪瘟石门毒株感染克隆构建及病毒拯救

1．材料与方法

2 结果

3 讨论

第三章 基于石门和C株感染性克隆的嵌合猪瘟毒株构建及其特性分析

1 材料与方法

2 结果

3．讨论

第四章 猪瘟病毒NS2蛋白跨膜区功能初步探索

1 材料与方法

2 结果

3．讨论

结论

创新点

参考文献

作者简介

攻读博士期间发表的论文成果

致谢