深度测序鉴定玉米病毒及感病玉米组织中小RNA分析

摘要

玉米是世界上最重要的粮食作物之一，而玉米病毒病害的发生给玉米生产带来了严重损失。明确玉米病毒种类及生物学特性是防治玉米病毒病发生的关键。深度测序技术突破了传统病毒鉴定方法的局限性，能同时检测植物样品中已知的和未知的、含量高及含量低的所有RNA病毒、DNA病毒以及类病毒。这种新的测序技术极大地革新了植物病毒的检测方法，已成为目前病毒鉴定最为重要的前沿技术之一。本研究主要内容包括：
　　⑴利用小RNA深度测序技术鉴定了云南省和贵州省玉米病毒病的种类。通过contigs拼接和比对共鉴定了7种玉米病毒，分别为3种未知的RNA病毒并依次暂命名为:玉米黄化花叶病毒(Maizeyellow mosaic virus，MYMV)，玉米相关的形影病毒(Maize-associated umbravirus，MAUV)以及玉米相关的整体病毒1(Maize-associated totivirus1，MATV1);1种国内首次报道的DNA病毒:留尼旺玉米线条病毒云南分离物(Maize streak Reunion virus-YN isolate，MSRV-YN);3种已知的RNA病毒:玉米褪绿斑驳病毒(Maize chlorotic mottle virus，MCMV)，甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus，SCMV)，南方水稻黑条矮缩病毒(Southern riceblack-streaked dwarf virus，SRBSDV)。利用病毒来源的contigs以及小RNA设计引物，对上述3种未知的RNA病毒以及MSRV-YN进行了全长基因组的克隆。
　　⑵MYMV基因组全长5，642 nt，共编码6个开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，其ORF的大小及编码策略与黄症病毒科马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus，Luteoviridae)成员非常相似。全基因组核苷酸进化树分析以及6个ORFs的氨基酸序列进化树分析均显示MYMV与黄症病毒科马铃薯卷叶病毒属病毒成员聚为一簇，与该属成员玉米黄矮病毒-RMV(Maizeyellow dwarf virus-RMV)形成一个小的分支，具有最高的序列同源性，两者核苷酸序列相似性为73％，表明MYMV是该属的一个新的病毒成员。同时，构建了MYMV的全长cDNA侵染性克隆，RT-PCR及Northern blot结果均显示该侵染性克隆能成功地系统侵染本氏烟(Nicotmna benthamiana)。我们还证实MYMV编码的P0蛋白是一个较强的RNA沉默抑制子，能引起GFP转基因16c本氏烟的局部和系统沉默。随后，我们采集了云南省元江县、元谋县，贵州省长顺县、独山县的玉米样品，克隆了12个MYMV分离物的全长基因组，并分析了全基因组核苷酸水平的变异进化情况。分析结果显示MYMV核苷酸水平整体变异低于4％，基因组上的遗传多样性存在较明显的波动，但在外壳蛋白(Coat protein，CP)、运动蛋白(Movement protein，MP)等保守区域变异较小。
　　⑶MAUV基因组全长3，040 nt，编码一个功能未知的ORF1和一个大小约80kDa的RNA依赖的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase，RdRp)融合蛋白。RdRp进化树分析显示MAUV与番茄丛矮病毒科，形影病毒属(Umbravirus,Tombusviridae)病毒成员聚为一簇，与该属成员柑橘黄脉病毒(Citrusyellowvein-associated virus)具有最高的序列同源性，形成一个小的分支，两者的核苷酸序列相似性和RdRp氨基酸序列相似性均为58.9％，表明了MAUV是形影病毒属潜在的一个新的病毒成员。
　　⑷MATV1基因组全长3，956 nt，编码一个功能未知的ORF1和一个大小约92kDa的RdRp融合蛋白。RdRp进化树分析显示MATV1与整体病毒科整体病毒属（Totivirus，Totiviridae）成员聚为一簇，与该属成员黑树莓病毒F(Black raspberryvirusF)具有最高的序列同源性，聚为一个小的分支，两者的核苷酸序列相似性为53.9％，RdRp氨基酸序列相似性46.0％，表明了MATV1是该属潜在的一个新的病毒成员。
　　⑸MSRV-YN是单链环状DNA病毒，基因组全长2，880 nt，编码位于病毒链上的运动蛋白(MP/V1)和外壳蛋白(CP/V2)，互补链上的复制相关Rep蛋白和RepA蛋白共4个ORFs，具有玉米线条病毒属基因组结构的典型特征。利用依赖于滚环复制的限制性内切酶片段长度多态性分析方法，将MSRV-YN侵染的样品作为模板经滚环扩增(Rolling circle amplification，RCA)，用BamHI限制性内切酶单酶切位点对RCA的扩增产物进行切割，得到了一条大小约3kb的单一条带。进一步的全基因组核苷酸序列进化树分析显示MSRV-YN与双生病毒科玉米线条病毒属（Mastrevirus，Geminiviridae）成员具有最高的序列相似性，与该属成员留尼旺玉米线条病毒(Maize streak Reunion virus)具有最高的全基因组核苷酸序列相似性，同源性达96.3％。
　　⑹小RNA是植物生长发育及环境响应的重要调节元件，处于基因表达调控的中心位置，了解MCMV侵染玉米的不同时间点的microRNA表达变化及调控规律对于病毒侵染植物以及植物抗病毒作用机制研究具有重要意义。利用小RNA深度测序技术，首次构建了MCMV侵染玉米后第15天(MA-M)和30天(MA-M1)叶片的小RNA文库。通过生物信息学分析共鉴定了321个已知的miRNA，组成26个已知的miRNA家族;同时还预测了379个新的miRNA。我们还对这些miRNA的靶基因及其功能进行了预测，这为下一步研究靶基因作用方式和作用机理奠定了基础。我们还发现病毒侵染的这两个不同时间点共有16种显著差异表达的已知miRNA，其中7种为下调表达，9种为上调表达，共隶属于10个miRNA家族。利用qRT-PCR技术分析了部分miRNA的表达水平，结果表明深度测序结果具有可靠性。此外，还分析了MCMV侵染的玉米叶片组织中病毒来源的siRNA(Smallinterfering RNA)。发现病毒侵染的第15天和第30天都能产生大量病毒来源的siRNA，且主要都是来源于病毒链，这些病毒来源的siRNA或跟寄主的抗病毒相关。同时还发现，随着侵染后期病毒滴度的下降，这些病毒来源的siRNA的数量也有所下降，热点区分布也表现出一定程度的不一致，在侵染第15天时基因组1100 nt和2899 nt处是产生siRNA的热点区(Hot spot)，而在侵染第30天时，该热点区几乎没有病毒来源的siRNA产生了(Cold spot)。
　　⑺植物病毒的协生作用能导致其中一种或两种病毒的积累量较单独侵染时增加，并且能引起比其中任何一种病毒单独侵染更加严重的病毒病害症状。为探究MCMV和SCMV复合侵染引起玉米致死性坏死病的机制，分别构建了MCMV单独侵染(MA-M)、SCMV单独侵染(MA-S)、MCMV和SCMV复合侵染(MA-MS)以及没有病毒侵染的玉米叶片(MA-H)的小分子RNA文库并进行深度测序。通过生物信息学分析，在四个小RNA文库中共鉴定了321种已知miRNA。分析MA-M_MA-H、MA-S_MA-H及MA-MS_MA-H之间共有的以及特有的差异表达miRNA，发现三组共有的差异表达的已知miRNA有28种，MA-M MA-H、MA-S_MA-H及MA-MS_MA-H各自特有的差异表达的miRNA分别有8、6、28种，对这些共有的和特有的差异表达的已知miRNA进行了GO聚类分析。利用qRT-PCR技术分析了部分miRNA的表达水平，结果表明深度测序结果具有可靠性。进一步预测了493个新的miRNA，并分析了三组共有的及特有的差异表达的novel miRNA，发现共有的差异表达的novel miRNA有34种，MA-M_MA-H、MA-S_ MA-H及MA-MS_ MA-H各自特有的差异表达的novel miRNA分别有16、25、20种，这些新的miRNA绝大部分是由于病毒侵染所诱导产生的。对这些共有的和特有的差异表达的novel miRNA进行了GO聚类分析，发现其靶基因在病毒的运动、病毒与宿主的互作中有显著富集，表明新的miRNAs对病毒侵染和寄主抗病毒贡献较大。最后，还分析了病毒来源的siRNA在病毒基因组中的分布情况。这些工作为深入解析植物协生作用的致病机理以及植物抗病毒基因工程提供了基础。

目录

声明

致谢

摘要

1 绪论

1．1 玉米病毒研究进展

1．1．1 引起玉米病毒病害的主要病毒

1．1．2 植物病毒协生作用研究进展

1．2 植物病毒检测技术研究进展

1．2．1 生物学检测法

1．2．2 电子显微镜检测法

1．2．3 血清学检测法

1．2．4 分子生物学检测法

1．2．5 第二代测序(Next-generation sequencing，NGs)检测法

1．3 植物miRNA概况及研究进展

1．3．1 植物miRNA的形成

1．3．2 植物miRNA的作用机制及其生物学功能

1．3．3 植物miRNA的研究方法

2 实验方法

2．1 实验材料与仪器

2．1．1 实验材料

2．1．2 试剂与仪器

2．2 常用的分子生物学技术

2．2．1 普通PcR

2．2．2 PCR产物回收纯化

2．2．3 质粒提取

2．2．4 连接反应

2．2．5 感受态细胞的制备

2．2．6 转化

2．2．7 菌落PCR鉴定重组质粒

2．2．8 酶切鉴定重组质粒

2．2．9 RACE-PCR(Rapid Amplification of cDNA Ends-PCR)

2．2．10 玉米叶片总RNA的提取

2．2．11 Northern印迹分析(Northern Blot)

2．2．12 植物RNA的反转录(参考天根试剂盒产品说明书)

2．2．13 Western印迹分析(Western Blot)

2．2．14 酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA)

2．3 生物信息学分析

2．3．1 原始数据处理及分析

2．3．2 病毒来源的小RNA分析

2．3．3 序列分析及系统进化树构建

2．3．4 基因组结构分析及假结预测

2．3．5 病毒的分子变异进化分析

3 利用小RNA深度测序技术鉴定玉米病毒

3．1 材料和方法

3．1．1 样品的采集和处理

3．1．2 小RNA深度测序样品的准备及样品送测

3．1．3 小RNA深度测序结果分析

3．1．4 病毒侵染性克隆的构建

3．1．5 病毒编码的沉默抑制子研究

3．2 结果与分析

3．2．1 小RNA深度测序鉴定未知的玉米RNA痛毒

3．2．2 小RNA深度测序鉴定巳知的玉米DNA病毒

3．2．3 小RNA深度测序鉴定己知的玉米病毒

3．2．4 田间样品痛毒复合侵染情况分析

3．3 讨论

4 玉米褪绿斑驳病毒(MCMV)侵染玉米的小RNA分析

4．1 材料与方法

4．1．1 实验材料及样品的收集处理

4．1．2 样品的准备与RNA提取

4．1．3 玉米小RNA文库的构建和Illumia测序

4．1．4 小RNA深度测序数据分析

4．1．5 荧光定量PCR(qRT-PCR)验证差异表达miRNA

4．2 结果与分析

4．2．1 病毒侵染植株症状及ELISA检测病毒滴度

4．2．2 数据质量及长度分布

4．2．3 公共的及特有的序列

4．2．4 基因组比对

4．2．5 已知miRNA的分析

4．2．6 新的miRNA及其靶基因预测

4．2．7 qRT-PCR验证差异表达的miRNA和新的miRNA

4．2．8 病毒来源地siRNA分析

4．3 讨论

5 玉米褪绿斑驳病毒(MCMV)和甘蔗花叶病毒(SCMV)复合侵染玉米的小RNA分析

5．1 材料与方法

5．1．1 实验材料

5．1．2 毒源

5．1．2 样品的准备与RNA提取

5．1．3 小RNA文库的构建和Illumia测序

5．1．4 小RNA深度测序数据分析

5．2 结果与分析

5．2．1 SCMV毒源的分离

5．2．2 病毒侵染植株症状反ELISA检测病毒滴度

5．2．3 数据质量厦长度分布

5．2．4 公共的及特有的序列

5．2．5 基因组的比对

5．2．6 已知miRNA的分析

5．2．7 新的miRNA及其靶基因预测

5．2．8 qRT-PCR验证实验结果

5．2．9 病毒来源的小RNA的热点区分析

5．3 讨论

参考文献

附录