禾谷镰刀菌中TOR信号途径与MAPK信号途径互作机制研究

摘要

真核生物中雷帕霉素作用靶标(Target of Rapamycin，TOR)信号途径在感受胞外环境中的营养与胁迫、调控细胞生长中发挥重要作用。我们前期对禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)TOR信号途径研究发现，TOR信号途径不仅调控禾谷镰刀菌的致病与毒素合成、还与细胞壁完整性(CWI)途径互作共同调控病菌对细胞壁胁迫因子的反应。本文在此基础上深入研究禾谷镰刀菌中TOR信号途径与高渗透性甘油(HOG)信号途径的相互作用机制，并系统研究了Gpmk1信号途径关键元件的生物学功能，解析TOR信号途径与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号途径的互作，主要研究结果如下:
　　1、禾谷镰刀菌中TOR信号途径上蛋白激酶FgSch9调控病菌气生菌丝的生长、菌丝分枝和孢子萌发。FgSCH9敲除突变体对渗透胁迫、氧化胁迫、细胞壁胁迫因子以及雷帕霉素的敏感性显著升高，对高温胁迫表现抗性。鉴定到FgSch9的互作蛋白FgMaf1，发现FgMaf1与FgSch9共同调控禾谷镰刀菌的致病以及DON毒素的合成。免疫亲和捕获和免疫共沉淀实验发现FgSch9可以同时与FgTor及FgHog1互作，FgSCH9敲除突变体与FgHOG1敲除突变体对外界的渗透胁迫与氧化胁迫的敏感性均显著增加，而且双敲突变体对外界胁迫的敏感性高于单敲突变体，表明TOR与HOG信号途径互作共同调控病菌对渗透和氧化等外界胁迫反应。
　　2、禾谷镰刀菌TOR信号途径上Rag-GTPase FgGtr1与FgGtr2以复合体形式调控了病菌气生菌丝的生长、产孢、孢子萌发、致病以及DON毒素的合成。免疫亲和捕获和免疫共沉淀实验发现复合体FgGtr1-FgGtr2可以与TOR下游的关键元件FgTap42互作;有趣的是，FgGtr1-FgGtr2复合体可以与FgHog1互作，FgGTR1与FgGTR2基因的缺失导致病菌对适乐时（激活HOG信号途径的杀菌剂）的抗性增强。该研究结果进一步证明TOR与HOG信号途径存在相互作用。
　　3、在模式酵母中，Sho1是HOG途径上游响应外界渗透胁迫的受体蛋白。我们研究发现，禾谷镰刀菌中Sho1的同系物(FgSho1)在病菌对渗透胁迫的抗逆反应并不发挥重要作用，但FgSho1参与调控病菌的菌丝生长、产孢、致病以及DON毒素合成，此外，△FgSho1对细胞壁胁迫物质的敏感性显著增加。Westernblotting试验发现，FgSho1可以正向调控细胞壁完整性(CWI)信号途径中关键激酶FgMgv1的磷酸化水平。酵母双杂、免疫共沉淀与荧光共定位实验发现，FgSho1可以与MAPK激酶复合体FgSteS0-FgSte11-FgSte7互作;与FgSho1类似，FgSte50-FgSte11-FgSte7复合体也参与调控病菌的菌丝生长、产孢、致病以及DON毒素合成，该复合体每个组分的突变体在麦穗上完全丧失致病力;Westernblotting试验验发现，FgSho1与MAPK激酶复合体FgSte50-FgSte11-FgSte7可以正向调控FgGpmk1的磷酸化水平。该研究结果表明，禾谷镰刀菌中FgSho1是FgGpmk1和CWI信号途径上游的一个受体蛋白。
　　4、鉴定到FgGpmk1下游一个转录调控因子FgSte12，发现FgSte12并不参与调控禾谷镰刀菌的菌丝生长、分生孢子的形成以及DON毒素合成，但△FgSte12完全丧失致病性，并且胞外蛋白酶与纤维素酶的分泌显著减少，表明FgGpmk1信号途径通过FgSte12调控病菌的致病性。
　　本研究结果表明，禾谷镰刀菌中TOR信号途径与多个MAPK信号途径互作共同调控病菌生长、致病、毒素合成等多个重要的生命活动。研究结果为发掘TOR途径上的新药靶提供重要依据。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 文献综述

1 禾谷镰刀菌(Fusarium geaminearum)研究概况

1．1 小麦赤霉病概述

1．2 禾谷镰刀菌的生物学特征

1．3 小麦赤霉病的防控

1．4 禾谷镰刀菌侵染机制研究进展

2 TOR(Target of Rapamycin)信号途径研究概况

2．1 真核生物中TOR蛋白复合体的结构与功能

2．2 真核生物中TORC1所介导的信号途径概述

2．3 病原真菌中TOR途径的研究进展

3 病原真菌中MAPK(Mitogen-activated protein kinase)信号途径的研究进展

3．1 病原真菌中HOG途径的研究进展

3．2 病原真菌中Fus3／Kss1途径的研究进展

3．3 病原真菌中CWI途径的研究进展

4．本研究目的与内容

第二章 材料与方法

1 实验材料

1．1 菌株

1．2 Western实验所用抗体

1．3 构建载体所用质粒

1．4 用于致病性实验所用植物材料

2 实验方法

2．1 禾谷镰刀菌的培养、保存、以及产孢方法

2．2 PCR技术

2．3 PCR产物纯化

2．4 禾谷镰刀菌基因组DNA的提取

2．5 DNA电泳方法

2．6 DNA克隆技术与载体构建

2．7 禾谷镰刀菌基因敲除、回补载体的构建以及转化子的鉴定

2．8 禾谷镰刀菌的原生质转化方法

2．9 禾谷镰刀菌转化子的Southern blot分析

2．10 禾谷镰刀菌RNA的提取以及基因表达水平分析

2．11 产孢量分析、子囊壳产生和菌丝孢子的染色

2．12 禾谷镰刀菌对细胞胁迫压力、杀菌剂敏感性的测定

2．13 禾谷镰刀菌致病性实验

2．14 禾谷镰刀菌菌丝孢子的显微镜镜观察

2．15 禾谷镰刀菌便染小麦后麦粒中DON毒素含量测定

2．16 酵母双杂交分析

2．17 FLAG和GFP标签融合蛋白载体构建

2．18 Western blot方法

2．19 蛋白质免疫共沉淀

2．20 亲和捕捉实验

第三章 结果与分析

1．禾谷镰孢菌中TOR信号途径与HOG信号途径之间的相互作用

1．1 禾谷镰刀菌中蛋白激酶FgSch9介导了TOR信号途径与HOG信号途径的互作

1．2 禾谷镰刀菌中Rag-GTPases介导了TOR信号途径与HOG信号途径之间的互作

1．3 小结与讨论

2．禾谷镰刀菌中Gpmk1信号途径关键元件的功能分析

2．1 禾谷镰刀菌中Gpmk1上游信号感受元件的功能分析

2．2 禾谷镰刀菌中Gpmk1下游转录因子FgSte12的功能研究

2．3 禾谷镰刀菌中TOR信号途径与Gpmk1信号途径之间的联系

2．4 小结与讨论

第四章 全文结果和后续工作展望

1．全文结果

2．未来工作展望

参考文献

附录A：引物序列

附录B：培养基配方

附录C：常用试剂和试验仪器

附录D：作者简历及攻读博士学位期间已发表论文