水稻miR393a/OsTIR1模块在种子萌发时胚芽鞘和胚根中的时空表达模式及其功能研究

摘要

miRNA393是植物中一个保守的microRNA家族，其功能研究主要包括植物免疫反应、生长发育和胁迫反应三个方面。迄今，miR393/靶基因表达在种子萌发中的调控机制和生物学功能尚无报道。水稻是重要的禾本科作物，具有能在水淹条件下种子萌发和生长的独特生长习性。其中空结构的胚芽鞘通过不断伸长至氧气充足的水面，以获得种子萌发所需的氧气，为水稻提供了一个水淹环境下的生存机制。我们前期实验发现水稻miR393的靶基因是生长素受体基因OsT1R1和OsAFB2，且miR393a在胚芽鞘中强表达，在此基础上，我们将进行miR393a/靶基因在水淹条件下种子萌发中的表达与功能研究。本文以水稻为研究材料，构建了一系列miR393及其靶基因表达的转基因株系，希望通过对其转录位点、表型及调控机制的研究，探索miR393a/OsT1R1在水稻种子萌发时胚芽鞘和胚根生长中的作用。获得主要实验结果如下：
　　一、在转录活性上的特征
　　(1) OsTIR1与OsAFB2的转录活性部位不同。OsTIR1转录活性主要在主根、不定根和冠根的根尖，以及幼嫩的颖壳、叶舌和节中。而OsAFB2则主要在幼嫩的颖壳、叶节及节的部位。
　　(2)在种子萌发初期，MIR393a和Os TIR1的转录在不同组织（盾片，胚根，胚芽鞘，侧根）呈现重叠、互补、相邻的三种空间对应特点。
　　(3)水稻胚芽鞘气孔由一对肾形的保卫细胞构成，不同于叶片气孔中典型的哑铃型保卫细胞。启动子分析发现MIR393a在气孔形成早期的拟分生组织（meristemoid）中强烈转录，暗示miR393可能参与了气孔发育的调控。指示生长素反应的DR5启动子元件在气孔发育的整个过程中都有转录活性，在成熟的气孔保卫细胞中最强。
　　二、对水稻萌发阶段生长发育及相关基因的影响
　　(1) miR393表达促进水稻萌发初期胚根的生长，并抑制侧根的生长。显微观察发现，MIR393过表达株系的胚根伸长区的长度增长，细胞数目增多，而MIM393株系伸长区变短，细胞数减少。
　　(2)过量表达miR393抑制胚芽鞘和胚芽鞘顶端气孔的生长，并使胚芽鞘中的细胞壁松弛因子(Expansin)基因EXPA4，EXPA7和EXPB12基因的转录水平下降。
　　(3)经气相色谱-质谱联用(GC-MS)法对游离生长素含量的测定结果显示，miR393促进胚芽鞘中游离生长素的积累。同时qRT-PCR结果显示过表达miR393可以提高胚芽鞘中生长素合成关键基因Os YUCCA1和Os YUCCA4的转录水平。
　　三、在水淹条件和ABA处理中的调控机制
　　(1)水淹(submergence)减弱了MIR393口在胚芽鞘尖端和其上气孔中的转录活性，并增强了其中的DR5反应。
　　(2) ABA处理抑制胚芽鞘生长，增强了MIR393a在胚芽鞘尖端和气孔中的转录活性，并减弱了其中的DR5反应。ABA对水稻胚芽鞘生长的抑制作用，很可能与EXPA2和EXPA4有关。
　　(3) Northern blot结果显示，OsTIR1可以正向反馈调节miR393的积累水平。
　　综上所述，本研究发现MIR393a在胚根基部、侧根原基、胚芽鞘尖端和即将形成气孔的拟分生组织中具有强转录活性，通过调控生长素信号途径影响主根、侧根、胚芽鞘的生长和气孔的发育，并且影响胚芽鞘内源生长素的积累水平。此外，MIR393a的转录水平受水淹胁迫的抑制和植物激素ABA处理的诱导，还受到靶基因OsTIR1的正向反馈调节作用。我们的研究揭示了MIR393a及其靶基因在水稻种子萌发初期的调控作用。

目录

声明

致谢

摘要

缩略语表

第一章 综述

1 miR393的研究现状

1．1 miRNA的筒介

1．2 miR393及其靶基因

1．3 miR393的功能研究

1．4 miR393对胁迫的响应

1．5 miR393与激素信号通路

2 生长素信号通路的研究进展

2．1 生长素的差异分布

2．2 生长素信号途径

2．3 生长素信号途径对植物生长发育的影响

3 本研究的内容和意义

第二章 水稻miR393a基因与其靶基因OsTIR1的表达特征研究

1 实验材料与方法

1．1 材料

1．2 菌株与质粒

1．3 试剂和主要仪器

1．4 启动子克隆和表达戴体构建

1．5 转基因

1．6 转基因株系的鉴定

2 实验结果

2．1 miR393的靶基因OsTIR1及OsAFB2的转录活性部位

2．2 种子萌发初期miR393a及其靶基因OsTIR1启动子的时空表达

2．3 主根和侧根中miR393a及其靶基因OsTIR1的时空表达

2．4 胚芽鞘气孔中MIR393a的表达

3 讨论

3．1 MIR393a和OsTIR1转录活性部位的空间对应关系

3．2 水稻胚芽鞘气孔与叶片气孔的不同结构

3．3 胚芽鞘气孔中MIR393a的表达与生长素反应

第三章 水稻miR393表达在种子萌发初期中的功能研究

1 实验材料与方法

1．1 材料

1．2 主要实验试剂

1．3 主要实验仪器

1．4 实验方法

2 实验结果

2．1 35S∷MIM393转基因株系的分子鉴定

2．2 miR393对水稻胚根生长的影响

2．3 miR393对水稻侧根生长的影响

2．4 miR393对水稻胚芽鞘生长及其相关基因的作用

2．5 miR393表达对水稻气孔发育及其相关基因的影响

2．6 miR393表达对内源生长素水平及其相关基因的影响

2．7 miR393表达对水稻叶片气孔发育的影响

3 讨论

3．1 miR393水平变化引起的多效性生长素相关表型

3．2 miR393水平对生长素积累的影响

3．3 miR393、生长素与水稻胚芽鞘气孔发育的关系

第四章 水淹胁迫及外源激素ABA与miR393基因表达的关系

1 实验材料与方法

1．1 材料

1．2 实验方法

2 实验结果

2．1 水淹条件影响胚芽鞘中miR393a的转录和DR5反应

2．2 水淹条件影响胚芽鞘伸长和气孔发育相关基因的转录

2．3 低氧胁迫条件对水稻植株生长与miR393积累量的影响

2．4 miR393的表达水平影响水稻在无氧胁迫中的生根

2．5 ABA增强胚芽鞘中miR393a的转录并减弱DR5反应

2．6 ABA影响EXPASIN基因在胚芽鞘中的转录

3 讨论

3．1 水淹与miR393和DR5反应的关系

3．2 miR393的表达水平影响水稻在无氧胁迫下的生根

3．3 ABA影响miR393a的转录和DR5反应

第五章 OsTIR1在水稻生长发育中的功能研究

1 实验材料与方法

1．1 材料

1．2 试剂和主要仪器

1．3 OsTIR1和OsmTIR1过量表达载体的构建

1．4 OsTIR1和OsmTIR1自身启动子载体的构建

1．5 水稻转基因及纯合株系筛选

1．6 RT-PCR

1．7 Northern blot检测

1．8 实时定量PCR

2 实验结果

2．1 OsTIR1各转基因株系的鉴定

2．2 OsTIR1各转基因株系胚芽鞘的表型

2．3 OsTIR1各转基因株系植株在无氧胁迫条件下的生根

2．4 OsTIR1各转基因株系种子重量的表型

2．5 35S∷OsmTIR1种子的代谢组分析结果

2．6 OsTIR1对miR393的正向反馈调控

3 讨论

3．1 水稻miR393介导的OsTIR1调控影响植株的生长发育

3．2 OsTIR1对miR393的正向反馈调控

第六章 总结和展望

1．总结

1．1 miR393a／OsTIR1在种子萌发初期的表达模式

1．2 miR393表达对水稻生长发育和相关基因的影响

1．3 miR393表达受水淹胁迫和外源激素ABA的影响

1．4 miR393／OsTIR1影响水稻在无氧胁迫条件下的生根

1．5 miR393调控水稻胚芽鞘生长与气孔发育的模型

2．本研究创新点

3．展望

参考文献

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