PICK1相互作用蛋白在ASICs及AMPA受体转运中的作用及相关机制研究

摘要

PICK1(Protein that interacts with C kinase1)是一种周边膜蛋白，是和蛋白激酶Cα(PKCα)相互作用的蛋白之一。PICK1可以通过其特殊的PDZ结构域与很多膜蛋白发生结合，例如PICK1不仅可以与酸敏感离子通道ASIC(acid-sensing ion channels)通道蛋白相互结合，也可以和离子型谷氨酸受体AMPA(α-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazoloe-4-propionic acid-type)受体的亚单位之一GluA2结合。在大多数情况下，PICK1可通过改变被结合蛋白的亚细胞转运或表面表达来调节蛋白的转运。凭借这些功能特点，PICK1既可以调节酸敏感离子通道ASIC(acid-sensing ion channels)的表面表达，也可以在突触可塑性中调节AMPA受体的转运过程。已有的证据表明，PICK1可以与ASIC1a及ASIC2a直接结合，通过影响ASIC蛋白的表面表达来介导细胞的酸毒性，进雨参与调节细胞凋亡，但PICK1是通过何种方式介导细胞酸毒性的还不是很清楚。另外，在体内生理情况下，ICA69(Islet Cell Autoantigen69 kDa)已被证实可以与大部分PICK1形成异源二聚体，并且他们二者的结合可以影响AMPA受体的分布。然而，PICK1和ICA69调节AMPA受体转运的具体分子机制还不明确。我们的实验结果显示:syntabulin可以与PICK1直接结合，并通过PICK1影响ASIC2的表面表达水平，最终参与调节神经元的酸毒性。同时，KIF2C也可以与PICK1有直接的相互作用，并且能通过PICK1和ICA69以及AMPA受体形成复合物，进而影响AMPA受体的膜表面表达。
　　目的:筛选出与PICK1有直接相互作用的蛋白，并分析其功能，一方面探究syntabulin与PICK1的相互作用是否会调节神经元的凋亡，另一方面探索KIF2C与PICK1的相互作用是否会影响AMPA受体的分布，在现有的基础上进一步探明ASIC及AMPA受体转运的分子机制，期望最终能够回答ASIC受体调节神经元凋亡的分子机制及AMPA受体上膜、下膜的动态过程，为细胞凋亡和学习记忆的基本原理提供理论基础。
　　方法:我们利用酵母双杂交、免疫共沉淀，高效液相层析质谱筛选出与PICK1有相互作用的目标蛋白;利用蛋白免疫印迹，免疫细胞化学进一步验证筛选出的目标蛋白syntabulin和KIF2C;利用激光共聚焦显微镜和表面生物素化实验一方面观察syntabulin对ASIC受体表面表达及细胞凋亡的影响，另一方面观察KIF2C对AMPA受体表面表达的影响。
　　结果:(1)研究发现，在培养的海马神经元中敲减syntabulin后，酸性刺激条件下会引起神经元的凋亡。表面生物素化结果显示，在培养的海马神经元中敲减syntabulin后，ASIC2的表面表达水平降低，同时ASIC2的总体表达水平升高。体外的免疫共沉淀显示，syntabulin可以通过PICK1与ASIC1a，ASIC2a形成复合物，但与ASIC1a相比，syntabulin能够通过PICK1结合更多的ASIC2a。通过细胞免疫荧光染色实验，观察到syntabulin能够通过PICK1与ASIC2a共定位，而在没有PICK1时，syntabulin与ASIC2a并不存在共定位。syntabulin与ASIC1a在有没有PICK1的情况下，都不会存在共定位。(2)高效液相层析质谱实验结果显示，19个蛋白与PICK1有相互作用，15个蛋白与ICA69有相互作用。在筛选到的蛋白中，KIF2C与PICK1有直接的相互作用，并且能够通过PICK1和ICA69形成一个复合物。KIF2C和PICK1之间的相互作用不会增强或减弱PICK1与GluA2之间的结合，并且也不会影响PICK1与GluA2形成的co-cluster。在体内生理条件下，KIF2C主要在大脑和睾丸中表达，并且在大脑中能够与GluA2结合。经体外验证，这种结合是通过PICK1实现的，在没有PICK1的情况下，KIF2C不能与GluA2有相互作用。在293T细胞中，过表达KIF2C可以降低GluA2表面表达水平，当PICK1和KIF2C共同过表达时，GluA2的表面表达水平进一步降低，这种现象是由两方面因素引起的，一方面是因为KIF2C本身可以解聚微管，另一方面是因为PICK1本身也可以降低GluA2的表面表达水平。在体外培养的海马神经元中，KIF2C可以与PSD-95以及GluA2共定位，过表达KIF2C也可以降低GluA2的表面表达。
　　结论:(1)我们的研究表明，syntabulin能够通过PICK1与ASIC通道蛋白形成复合物，进而改变ASIC2的表面表达水平及总体表达水平，最终调节神经元的酸毒性。(2)我们的研究表明KIF2C与PICK1有直接的相互作用，并且通过这种相互作用进一步结合GluA2，形成一个复合物，最终以降低GluA2表面表达水平的形式参与AMPA受体的转运。

目录

声明

致谢

摘要

缩略语

1 引言

1．1 AMPA受体概述

1．2 酸敏感离子通道(ASICs)概述

1．3 PICK1的结构特性及与ASICs、AMPA受体的关系

1．4 ICA69的结构及其功能研究

1．5 Kinesin蛋白家族对AMPA受体转运的调节

1．6 微管结合蛋白syntabulin的功能研究现状

2 材料和方法

2．1 主要仪器及型号

2．2 试剂

2．3 抗体

2．4 分子克隆

2．5 HEK293T及COS7细胞的培养和转染

2．6 HEK293T细胞免疫荧光染色

2．7 原代神经元的培养和转染

2．8 免疫共沉淀

2．9 Western-blot

2．9 考马斯亮蓝染色

2．10 表面生物素化实验

2．11 质谱实验

2．12 慢病毒制备

2．13 数据统计与分析

3 结果

3．1 PICK1，syntabulin与酸敏感离子通道(ASICs)

3．2 PICK1，KIF2C与AMPA受体

4 讨论与展望

4．1 讨论

4．2 展望

5 结论

参考文献

综述

作者简介及在读期间取得的科研成果