双水相萃取胰岛素前体及复性分离新工艺研究

摘要

重组胰岛素类药物大多通过重组大肠杆菌生产，表达胰岛素前体，再经包涵体溶解、复性、酶切和纯化等得到胰岛素。胰岛素前体的复性常采用稀释变性剂的方式，在工业生产上，需要用到大量的尿素，复性液后续纯化前还需浓缩，存在工作体积大、设备投资大、废水量大等缺点。因此，开发一种高效、环保、经济的新工艺替代具有重要的意义。双水相萃取技术在蛋白纯化方面已有广泛的研究与应用，具有生物相容性好，成本相对较低，环境污染风险低等优点。本文探讨了双水相萃取法从复性浓缩液中提取胰岛素前体，以及从包涵体溶解液中直接复性萃取胰岛素前体的可行性，并与稀释复性工艺进行比较。主要结果如下：
　　(1)采用聚乙二醇/硫酸铵双水相系统从复性浓缩液中萃取胰岛素前体。比较了PEG3000和PEG4000与硫酸铵形成双水相的相图，确定PEG4000/硫酸铵为适合的双水相体系。以胰岛素前体在下相中的收率(Yi)和纯度(Pi)为响应值，考察了PEG浓度、硫酸铵浓度、尿素浓度等对胰岛素前体萃取分离的影响，通过实验优化，确定了最佳条件为PEG4000浓度11.41％、硫酸铵浓度10.77％、pH9.58，胰岛素前体的收率为94.8％，纯度为86.7％。
　　(2)采用PEG4000/硫酸铵双水相系统直接从包涵体溶解液中复性萃取胰岛素前体。以下相中胰岛素前体的收率(Yi)和纯度(Pi)为响应值，确定了PEG浓度、硫酸铵浓度、总蛋白含量、pH等四个因子对胰岛素前体的复性萃取有显著影响，优化得到最佳条件为11.5％ PEG4000、10.7％硫酸铵、pH10.0，该条件下胰岛素前体的收率为44.3％，纯度为83.8％。对双水相复性获得的胰岛素前体样品进行酶切，以及后续纯化和结晶，结果表明新工艺所获得的胰岛素与原工艺无差异。与原工艺比较，双水相萃取复性及分离胰岛素前体工艺在设备投入、废水处理等方面具有明显的优势。
　　本文实现了双水相萃取从复性浓缩液中分离胰岛素前体，以及包涵体溶解液中直接复性萃取具有正确空间结构的胰岛素前体，证实了双水相萃取工艺的可行性，为进一步应用研究打下了良好基础。

目录

声明

致谢

摘要

缩略语表

第一章 文献综述

1．1 引言

1．2 糖尿病及治疗方式

1．3 胰岛素

1．3．1 胰岛素简介

1．3．2 胰岛素的结构

1．3．3 胰岛素的分类

1．3．4 胰岛素的表达系统

1．3．5 胰岛素的分离纯化

1．4 双水相系统和双水相萃取

1．4．1 双水相系统

1．4．2 双水相萃取的发展

1．4．3 双水相萃取的特点

1．4．4 双水相萃取的应用

1．5 本文研究思路

第二章 双水相萃取从复性浓缩液中提取胰岛素前体

2．1 引言

2．2 材料和方法

2．2．1 试剂与材料

2．2．2 主要仪器与设备

2．2．3 PEG／硫酸铵双水相系统的相图测定

2．2．4 BCA法测定总蛋白浓度

2．2．5 RP-HPLC法测定胰岛素前体浓度

2．2．6 PEG和尿素对BCA与HP-HPLC法影响

2．2．7 胰岛素前体复性超滤波缩液制备

2．2．8 PEG4000／硫酸铵双水相萃取

2．2．9 响应面法实验设计及优化

2．3 结果与讨论

2．3．1 PEG／硫酸铵双水相系统的相图

2．3．2 PEG4000与尿素对BCA法和RP-HPLC法测定的影响

2．3．3 PEG4000／硫酸铵双水相从复性浓缩液中萃取胰岛素前体

2．3．4 双水相萃取胰岛素前体的分离条件分析

2．3．5 双水相萃取胰岛素前体的优化与验证

2．4 本章小结

第三章 双水相萃取从包涵体溶解液中直接复性分离胰岛素前体

3．1 引言

3．2 材料和方法

3．2．1 试剂与材料

3．2．2 主要仪器与设备

3．2．3 包涵体溶解液(IBD)制备

3．2．4 复性萃取实验

3．2．5 尿素对PEG4000／硫酸铵双水相复性萃取胰岛素前体的影响

3．2．6 两水平因子实验设计筛选条件

3．2．7 响应面法实验设计及优化

3．2．8 双水相复性萃取最佳条件的验证及与原工艺的比较

3．3 结果与讨论

3．3．1 尿素对PEG4000／硫酸铵双水相体系复性萃取胰岛素前体的影响

3．3．2 两水平因子实验设计筛选条件

3．3．3 显著性影响因子的优化设计

3．3．4 双水相复性萃取条件的优化与验证

3．3．5 两种工艺的比较

3．3．6 胰岛素前体的酶切与纯化

3．4 本章小结

第四章 结论与建议

4．1 结论

4．2 建议

参考文献