单核细胞增生李斯特菌：应激转录组学与RsbX对SigB表达和细菌存活的调控

摘要

单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，简称单增李斯特菌），为低G+C含量的革兰氏阳性无芽孢杆菌，能引起人和动物的感染。该菌有很强的环境适应能力，可以在高渗透压(10-20％ NaCl)、宽泛的温度(0.4-45℃)和pH(2.5-9)条件下生长。人因食用单增李斯特菌污染的食品而发生李斯特菌病，出现胃肠炎、败血症、脑膜炎和孕妇流产等严重的病症，死亡率高达30％。
　　在自然环境、食品加工和储存环境以及宿主胃肠道中存在各种不同的应激，而成功抵抗这些应激是单增李斯特菌在环境或食品中生存并建立感染的关键因素之一。作为单增李斯特菌中最重要的应激调控因子，Sigma B(σB)对细菌能否在应激环境中成功启动抗应激基因的表达和生存至关重要。然而，σB能否在遭遇应激时与RNA聚合酶结合形成全酶(RNAP)进而启动相应的抗应激基因转录，并在应激结束后及时将细菌调回低活力状态从而降低能耗的过程亦受到其调控操纵子的精密调控。与枯草芽孢杆菌相类似，单增李斯特菌σB与其七个调控子(Regulator of Signa B: rsbR, rsbS, rsbT, rsbU, rsbV, rsbW和rsbX)共表达，这些调控操纵子主要通过磷酸化/去磷酸化作用来实现应激调控。在该调控网络中，对启动应激的机制研究较为深入:去磷酸化的RsbV竞争性地结合RsbW，σB被释放并与RNA聚合酶结合形成全酶;而应激结束后，该系统是如何结束应激模式，使细菌恢复至低活力状态的过程却鲜有研究报道。
　　本研究旨在:(1)获得携带σB启动子与gfp基因融合的报告质粒，用于研究单增李斯特菌在应激条件下σB活性;(2)应用转录组学技术探寻不同应激条件下相关基因表达水平变化的特点;(3)探明单增李斯特菌RsbX在应激过程中和生长稳定期对σB的调控作用。
　　以pERL3为骨架，通过SOE-PCR技术成功构建了携带3个不同σB依赖型启动子与gfp融合的报告基因载体，并利用荧光酶标仪分析携带这些载体的单增李斯特菌在酸或盐应激条件下的报告基因表达水平。结果表明，sigB自身启动子Psigb比P0880和P1602更为敏感，可准确指示σB的活性;盐应激比酸应激对σB的激活程度高;5％的NaCl浓度和30 min的应激时间足以对σB产生显著的激活效应。该报告载体可用于应激条件下σB激活机制的研究。
　　运用RNA-Seq技术分别对经过30 min酸应激(pH4.8)、盐应激(5％ NaCl)和过氧化氢应激(5 mM H2O2)的单增李斯特菌进行转录谱分析，分别发现了26、29和55个显著的差异表达基因（差异＞2倍，P值＜0.05）。GO分析显示这些差异表达基因主要与代谢过程相关。PCA分析发现盐应激和过氧化氢应激组表现出相类似的转录谱，且这两个应激组中也有更多相同的差异表达基因，提示盐应激和过氧化氢应激对单增李斯特菌的激活方式相似或是细菌对这两种应激的耐受方式有着较为密切的联系。而酸应激组的转录谱和差异表达基因结果则显示其作用相对独立于其他两种应激。这些结果为后续应激调控机制研究提供了参考。RsbX是σB调控子中相对独立的一个，枯草芽孢杆菌RsbX被认为是σB调控子中唯一的负调控因子。本研究中，我们通过基因缺失和回补技术，发现rsbX基因的缺失并不影响单增李斯特菌在pH4.8或5％ NaCl应激培养基中的生长能力，且rsbX基因缺失株在高盐应激(15％ NaCl)培养基和交叉应激试验中的存活率与野生株相比均无差异。由此，我们认为rsbX基因不直接介导单增李斯特菌的抗应激能力。分子水平的检测也显示经过0.5h的5％ NaCl应激，rsbX基因缺失株与野生株的σB转录和蛋白水平均无显著差异，表明RsbX的缺失不影口向应激诱导的σB激活。
　　为了探究RsbX在李斯特菌抗应激中的作用，我们设计了应激=恢复生长-再应激试验。rsbX基因缺失株在恢复生长0.5 h-1.5 h后抵抗二次应激的能力显著高于野生株。经RT-PCR、启动子活性检测以及Western blot证实，rsbX基因缺失株这种二次应激存活率提高得益于恢复生长阶段显著升高的σB表达水平（高于野生株），表明RsbX在应激后恢复期负调控σB，将其从高活力状态下调至正常水平。同时，我们发现sigB基因缺失株在应激后恢复生长阶段的ATP水平显著高于野生株，而rsbX基因缺失株的ATP水平则显著低于野生株和sigB基因缺失株，表明σB介导的应激调控过程可能涉及细菌的能量消耗。
　　比较了rsbX基因缺失株和野生型菌株的对数生长期和平台期培养物对高盐应激的差异，我们发现rsbX基因缺失不影响对数生长期细菌对15％ NaCl应激培养基的存活率，但rsbX基因缺失株平台期培养物对高盐应激的存活率显著高于野生株。平台期rsbX基因缺失株的σB表达水平也显著高于野生株，表明RsbX对σB的负调控作用不仅体现在应激后恢复期，也表现在细菌生长平台期。
　　综上所述，本研究构建了可准确指示σB活性的报告载体;证明了RsbX为单增李斯特菌σB的负调控因子，且该负调控作用表现在应激后恢复期和生长平台期;发现了单增李斯特菌10403S在酸应激、盐应激和过氧化氢应激中的差异表达基因以及不同应激间可能存在的联系;该研究结果为进一步探究单增李斯特菌的应激调控机制提供了基础。

目录

声明

摘要

英文摘要

第一部分 文献综述

第一章 文献综述

1 单核细胞增生李斯特菌概述

2 单核细胞增生李斯特菌的致病机理

3 单核细胞增生李斯特菌的毒力因子及其调控

4 单核细胞增生李斯特菌的抗应激作用

5 研究目的

第二部分 试验研究

第二章 单核细胞增生李斯特菌报告质粒的构建及其在抗应激研究中的应用

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第三章 转录组测序(RNA-Seq)技术分析单核细胞增生李斯特菌在不同应激中的基因表达差异

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第四章 单核细胞增生李斯特菌rsbX基因的生物学功能

第一节 单核细胞增生李斯特菌rsbX缺失株的构建以及抗体制备

第二节 单核细胞增生李斯特菌rsbX基因的生物学功能分析

第三节 讨论

第五章 单核细胞增生李斯特菌rsbX基因在抗应激过程中的作用机制

第一节 单核细胞增生李斯特菌rsbX基因的抗应激作用

第二节 单增李斯特菌rsbX基因在应激后的调控作用

第三节 单增李斯特菌rsbX基因在生长平台期的调控作用

全文结论

创新点

展望

参考文献

作者简介

致谢