马绒毛膜促性腺激素的分离纯化研究

摘要

马绒毛膜促性腺激素(Equine chorionic gonadotropin，eCG)，又名孕马血清促性腺激素(Pregnant mare serum gonadotropin，PMSG)，是一种糖蛋白激素，主要用于促进卵泡发育成熟、黄体生成及精子形成，可用于治疗牲畜死精、性欲不强、不孕等病症。市售eCG均自孕马血清中分离纯化得到，但由于它在孕马血清中的浓度较低（约为60IU/mL），且具有不均一性及易失活的特点，eCG分离纯化难度较大、生产成本较高。本文对孕马血清中eCG的分离方法进行研究，探索了适宜的分离、纯化方法，考察了离子交换层析在eCG分离纯化中的作用;并创造性地利用疏水作用层析进行了eCG的纯化和精制研究，取得较为理想的分离效果;最后考察了由卵巢增重法测定得到的eCG活性，eCG免疫活性与N-乙酰神经氨酸(N-acetyl neuraminic acid，Neu5Ac)的关系。
　　1)对粗分离的方法进行筛选，通过条件优化，确定了最佳沉淀条件，探索了从孕马血清中粗分离得到eCG的适宜方法，所得eCG的比活为80-150IU/mg，活性回收率达到90％以上。
　　2)利用离子交换层析，对eCG粗分离产物的进一步纯化进行了研究，筛选并确定适宜的介质，优选了上洗脱缓冲溶液条件。经一步离子交换层析，纯化产物比活达到1124.41IU/mg，活性回收率为53.68％。
　　3)探索了利用疏水作用层析进行eCG粗品纯化和精制的可行性，筛选比较了不同疏水作用层析介质的性能;考察了上样缓冲溶液组成及离子强度对eCG吸附性能的影响，确定最佳的上样缓冲溶液组成;优选适宜的分离条件。经一步疏水作用层析，纯化产物比活达到1429.86IU/mg，活性回收率达到88.66％。相对于离子交换层析，纯化效果得到显著提高。
　　4)探索了通过测定唾液酸(Neu5Ac)含量表征eCG活性的可行性。采用柱前衍生化方法，利用高效液相测定Neu5Ac的含量，优选最佳的衍生化温度、衍生化时间、衍生化反应物（O-phenylenediamine dihydrochloride，OPD）的浓度。通过考察优化了从eCG中水解释放Neu5Ac的水解反应方法和条件，并确定最佳水解时间、水解温度、水解反应物三氟乙酸（Trifluoroacetic acid，TFA）浓度;进行了水解液中Neu5Ac含量的HPLC测定，建立了孕马血清中Neu5Ac含量的测定方法;探讨了孕马血清中Neu5Ac含量与eCG活性的关系，研究表明由卵巢增重法测定得到eCG的活性，eCG免疫活性均与Neu5Ac含量呈正相关关系。

目录

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致谢

摘要

第—章 文献综述

1．1 孕马血清促性腺激素

1．1．1 eCG的组成

1．1．2 eCG的性质

1．1．3 eCG的生物学活性与功能

1．2 eCG的分离纯化

1．2．1 粗分离

1．2．2 纯化与精制

1．3 eCG活性

1．4 唾液酸及其检测

1．4．1 唾液酸的性质

1．4．2 唾液酸的功能

1．4．3 唾液酸的检测意义

1．4．4 唾液酸的检测方法

1．5 研究目的和意义

第三章 eCG的粗分离及离子交换层析纯化

2．1 引言

2．2 材料和方法

2．2．1 主要实验试剂

2．2．2 主要仪器和设备

2．3 实验方法

2．3．1 蛋白质纯度的测定

2．3．2 蛋白质浓度的测定

2．3．3 蛋白质活性的测定

2．3．4 粗分离

2．3．5 洗率及脱盐处理

2．3．6 离子交换层析

2．4 实验结果和讨论

2．4．1 粗分离条件的选择

2．4．2 洗率及脱盐处理结果与讨论

2．4．3 离子交换层析

2．5 本章小结

第三章 eCG的疏水作用层析纯化

3．1 引言

3．2 材料和方法

3．2．1 主要实验试剂

3．2．2 主要仪器和设备

3．3 实验方法

3．3．1 疏水作用层析介质选择

3．3．2 疏水作用层析洗脱条件选择

3．3．3 疏水作用层析上样缓冲液的选择

3．3．4 疏水作用层析纯化eCG验证实验

3．4 实验结果和讨论

3．4．1 疏水作用层析介质确定

3．4．2 疏水作用层析洗脱条件确定

3．4．3 疏水作用层析上样缓冲液的确定

3．4．4 疏水作用层析纯化eCG工艺

3．5 本章小结

4．1 引言

4．2 材料和方法

4．2．1 主要实验试剂

4．2．2 主要仪器和设备

4．3 实验方法

4．3．1 Neu5Ac的HPLC检测

4．3．2 样品水解

4．4 实验结果和讨论

4．4．1 Neu5Ac衍生化反应条件的确定

4．4．2 TFA水解eCG条件的确定

4．5 eCG中Neu5Ac含量的确定

4．6 本章小结

第五章 结论与展望

5．1 结论

5．2 展望

参考文献