功能表达来源于Klebsiella oxytoca KCTC1686的腈水合酶和酰胺酶及其应用

摘要

腈水合酶(NHase，E.C.4.2.1.84)和酰胺酶(Amidase，EC3.5.1.4)是微生物体内腈类化合物代谢途径中的两个关键酶。这两种酶在医药和精细化学品中间体的制备中发挥着重要作用，但在实际工业应用中还存在着酶的表达量偏低、表达不稳定和产物纯度不高等问题。S-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸(S-CPIAC)是合成S-氰戊菊酯的重要手性中间体，其可由腈水合酶和酰胺酶耦合催化2-(4-氯苯基)-3-甲基丁腈(CPIN)来制备。目前能催化该反应的酶数量少、催化活性低。因此，研究腈水合酶和酰胺酶的重组表达，进一步开发催化性能更好的酶，具有重要的理论意义和实用价值。本论文以腈水合酶和酰胺酶耦合催化CPIN合成S-CPIAC为模型，用基因组探矿的方法从生物信息数据库中挖掘新型腈水合酶和酰胺酶基因，分别实现其在E.coli中的高效表达;构建一菌多酶共表达体系，实现腈水合酶和酰胺酶耦合催化在制备S-CPIAC中的应用。主要内容如下：
　　(1)腈水合酶酶库的构建。目前已报道的只有三个微生物能催化CPIN水解生成2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酰胺(CPIAm)。因钴型腈水合酶既能催化脂肪族腈类化合物又能催化芳香族腈类化合物，所以以钴型腈水合酶α亚基的保守氨基酸序列为分子探针，在生物信息数据库中进行钴型腈水合酶基因的搜索。根据已报道的能催化CPIN的腈水合酶基因，选择了10个腈水合酶基因，通过PCR扩增技术获得目标基因片段，实现了其在E.coli中的可溶性表达，构建了一个包含10个不同来源腈水合酶的小型酶库。以CPIN为底物，对酶库进行筛选，这10个腈水合酶对底物均有催化活性，其中来自于Klebsiella oxytoca KCTC1686腈水合酶NHaseK的催化活力最高(71.2±7.37 U/g DCW)，是已报道腈水合酶活力的2.1倍。因此选取该酶来做进一步的研究。
　　(2)腈水合酶的高效功能表达。腈水合酶NHaseK由蛋白分子量分别为22.3kDa和24.0 kDa的α-和β-亚基构成，实验证明了17K是NHaseK的活化元件且对NHaseK的功能表达具有重要影响。当NHaseK的结构基因和17K基因以串联形式进行表达时，NHaseK的比活和总酶活分别为0.48 U/mg蛋白和120.1 U/L发酵液，但17K的表达量却非常低。为了提高17K的表达量和NHaseK的酶活，对表达元件进行了重新设计。当在17K基因的5'端引入一个高效SD序列(5'-AAGGAG-3')后，17K的表达量有了明显改善，NHaseK的比活和总酶活分别提高了56％和50％，达到0.75 U/mg蛋白和180.6 U/L发酵液。用Ni-亲和层析的方法纯化了NHaseK，并对其酶学特性进行了研究。NHaseK的最适反应pH为6.5，最适反应温度为35℃，在35℃以下具有较好的热稳定性;NHaseK的底物谱较广且具有S-型立体选择性，当其催化CPIN时，E值为17。因此，NHaseK在一些重要酰胺化合物的制备中具有很好的应用前景。
　　(3)酰胺酶KamH的高效功能表达。目前酰胺酶的重组表达，往往会形成包涵体或无活性的蛋白。酰胺酶基因通常和腈水合酶基因相偶联处于一个基因簇中，通过基因组信息分析，发现在选定的10种微生物基因组中均存在假设酰胺酶基因。通过PCR扩增技术获得这10个酰胺酶基因，用常规方法来进行重组表达，结果有大量包涵体生成且可溶蛋白也没有催化活性。与酰胺酶KamH相偶联的腈水合酶NHaseK具有最高的酶活力，因此选取KamH来进行高效功能表达研究，更换不同的质粒载体、培养基组成和诱导表达条件，KamH的表达效果均没获得明显改善。当用肠激酶将重组KamH酶蛋白N端的融合多肽切除之后，酶活力获得了部分恢复(4.2±0.25 U/L)。当以原生肽形式来进行重组表达时，KamH实现了可溶性表达且酶活达到35.6±1.61 U/L。N端融合的多肽不仅影响了KamH的可溶性表达，也影响了酶蛋白的催化活性。当以原生肽形式重组表达来源于Agrobacterium tumefaciens d3的酰胺酶DamH和来源于Rhodococcuserythropolis strain MP50的酰胺酶MamH时，同样实现了高效功能表达，其酶活分别为22.9±1.55 U/L和27.4±1.69 U/L。这表明，以原生肽形式表达法来实现酰胺酶的高效功能表达具有一定的通用性，这为酰胺酶的重组表达提供了一个可供选择的方法。
　　(4)酰胺酶KamH产酶条件优化及酶学特征研究。首先优化了培养基组成和诱导表达条件，在最优条件下发酵产酶，重组amH的酶活达到65.8±1.82 U/L，比初始发酵酶活提高了84.8％。之后对KamH的酶学特性进行了研究，KamH的最适反应pH为8.0，最适反应温度为40℃，在30℃以下具有较好的热稳定性;KamH的底物谱较广，在催化外消旋酰胺时展示出严格的S-型立体选择性（产物e.e.值＞95％）;用KamH来拆分CPIAm，在底物转化率接近50％时，产物e.e.值为97.5％，E＞200。这表明KamH在精细化学品和医药中间体行业中具有较好的应用前景。在进化树中，KamH和AS家族酰胺酶处于同一个分支中;KamH的氨基酸序列中含有AS家族酰胺酶特有的保守序列GGSSSGS和催化三联体Ser-cis Ser-Lys，催化三联体在KamH氨基酸序列中的位置为K96-S171-S195，这表明KamH属于酰胺酶家族分类中的AS家族。
　　(5)一菌多酶共表达体系的构建。构建了两类一菌多酶共表达体系，实现了腈水合酶NHaseK和酰胺酶KamH的共表达。首先构建了三个单质粒共表达体系，pETDuet-N-K、pRSFDuet-N-K和pCDFDuet-N-K，其中以pETDuet-N-K的表达情况最好，NHaseK和KamH的酶活力分别为46.4±2.52U/L和20.3±1.35U/L。然后又构建了三个双质粒共表达体系，pETDuet-N-A、pRSFDuet-N-A和pCDFDuet-N-A，其中以pETDuet-N-A的蛋白表达情况最好，NHaseK和KamH的酶活力分别为52.8±2.64U/L和22.9±1.48 U/L。两种共表达体系相比之下，双质粒共表达的效果要优于单质粒共表达的效果。用所构建的一菌多酶体系来催化CPIN，均获得了较高的产物光学纯度（CPIAC的e.e.值为99％）。

目录

声明

致谢

摘要

缩写符号术语表

第一章 绪论

1．1 腈类化合物及其水解

1．1．1 腈类化合物

1．1．2 腈类化合物的水解

1．2 腈水合酶

1．2．1 腈水合酶的来源与种类

1．2．2 腈水合酶基因序列和蛋白结构特征

1．2．3 腈水合酶的反应机理

1．2．4 腈水合酶的选择性

1．2．5 腈水合酶的重组表达

1．2．6 腈水合酶翻译后修饰

1．2．7 腈水合酶的应用

1．3 酰胺酶

1．3．1 酰胺酶的来源及分类

1．3．2 酰胺酶催化反应的机理

1．3．3 酰胺酶的立体选择性

1．3．4 酰胺酶的重组表达

1．3．5 酰胺酶在手性中间体合成中的应用

1．4 腈水合酶和酰胺酶的耦合催化

1．5 氰戊菊醑

1．6 本课题的研究思路与主要内容

第二章 腈水合酶基因克隆及其功能表达

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．2．1 实验仪器

2．2．2 主要试剂

2．2．3 宿主菌和质粒

2．2．4 培养基的配制和培养条件

2．2．5 野生菌株活化及基因组的提取

2．2．6 大肠杆菌感受态细胞的制备

2．2．7 核酸琼脂糖凝胶电泳

2．2．8 腈水合酶氨基酸序列比对及分子探针的设计

2．2．9 钴型腈水合酶基因信息的搜索

2．2．10 钴型腈水合酶基因的选择

2．2．11 腈水合酶基因的克隆

2．2．12 重组质粒的构建

2．2．13 重组质粒的转化和阳性转化子的验证

2．2．14 腈水合酶的重组表达

2．2．15 重组腈水合酶的酶活测定

2．3 结果与讨论

2．3．1 钴型腈水合酶的多序列比对

2．3．2 钴型腈水合酶保守序列分析和虚拟腈水合酶基因库的建立

2．3．3 钴型腈水合酶基因目标的选定

2．3．4 工程菌的构建及重组酶蛋白的表达

2．4 小结

第三章 腈水合酶NHaseK的高效功能表达及其酶学特性

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 实验仪器

3．2．2 主要试剂

3．2．3 主要试剂及溶液配制方法

3．2．4 菌株和质粒

3．2．5 培养基的配制和培养条件

3．2．6 腈水合酶NHaseK基因的克隆和重组质粒的构建

3．2．7 活化元件对NHaseK重组表达和其酶活的影响

3．2．8 表达元件的重新设计

3．2．9 重组质粒的转化和阳性转化子的验证

3．2．10 重组腈水合醇NHaseK的诱导表达

3．2．11 钴离子对细胞生长和重组NHaseK表达量的影响

3．2．12 菌体收集和细胞破碎

3．2．13 蛋白质SDS-PAGE电泳

3．2．14 蛋白浓度的测定

3．2．15 重组腈水合酶NHaseK的纯化

3．2．16 重组NHaseK活力的测定

3．2．17 重组NHaseK酶学特性的研究

3．3 结果与讨论

3．3．1 基因组DNA的提取和腈水合酶基因片段的扩增

3．3．2 重组菌的构建及NHaseK的重组表达

3．3．3 17K对重组NHaseK功能表达的影响

3．3．4 重构NHaseK的表达元件

3．3．5 钴离子对NHaseK重组表达的影响

3．3．6 重组腈水合酶NHaseK的纯化

3．3．7 重组NHaseK的酶学性质研究

3．4 本章小结

第四章 酰胺酶基因克隆及其功能表达

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．2．1 实验仪器

4．2．2 主要试剂

4．2．3 宿主菌和质粒

4．2．4 培养基配制和培养条件

4．2．5 酰胺酶基因的克隆和重组质粒的构建

4．2．6 酰胺酶的重组表达

4．2．7 表达载体对酰胺酶KamH重组表达的影响

4．2．8 基因簇中其它基因对KamH重组表达的影响

4．2．9 融合标签种类及其位置对KamH重组表达的影响

4．2．10 酰胺酶功能表达策略的验证

4．2．11 蛋白质SDS-PAGE电泳及蛋白浓度的测定

4．2．12 重组酰胺酶活力的测定

4．3 结果与讨论

4．3．1 酰胺酶的重组表达

4．3．2 表达载体对KamH重组表达的影响

4．3．3 基因簇中其它基因对KamH重组表达的影响

4．3．4 重组KamH的纯化及N端多肽的切除

4．3．5 重组表达不带融合标签的KamH

4．3．6 融合标签类型及其位置对KamH重组表达的影响

4．3．7 酰胺酶功能表达策略验证

4．4 本章小结

第五章 KamH的产酶条件优化及其酶学特性

5．1 前言

5．2 材料与方法

5．2．1 实验仪器

5．2．2 主要试剂

5．2．3 质粒与菌种

5．2．4 培养基配制和培养条件

5．2．5 蛋白质SDS-PAGE电泳及蛋白浓度的测定

5．2．6 重组KamH活性及其对映体选择性的测定

5．2．7 KamH的产酶条件优化

5．2．8 KamH酶学性质的研究

5．2．9 酰胺酶KamH拆分CPIAm的研究

5．2．10 酰胺酶KamH蛋白的基本理化性质分析

5．2．11 酰胺酶KamH的保守氨基酸序列分析

5．2．12 酰胺酶KamH的同源模建

5．3 结果与讨论

5．3．1 工程菌K-5发酵产酶培养基组分的优化

5．3．2 工程菌K-5发酵产酶诱导条件优化

5．3．3 重组酰胺酶KamH酶学特性的研究

5．3．4 酰胺酶KamH拆分CPIAm的过程

5．3．5 酰胺酶KamH氨基酸序列特征及进化树分析

5．3．6 酰胺酶KamH的保守氨基酸序列分析

5．3．7 同源模建及KamH蛋白空间结构分析

5．4 本章小结

第六章 双酶共表达体系的构建及耦合催化的初步研究

6．1 前言

6．2 材料与方法

6．2．1 实验仪器

6．2．2 主要试剂

6．2．3 宿主菌和质粒

6．2．4 NHaseK和KamH的共表达

6．2．5 单质粒共表达体系的构建

6．2．6 双质粒共表达体系的构建

6．2．7 双酶共表达体系的诱导表达

6．2．8 蛋白质SDS-PAGE电泳及蛋白浓度的测定

6．2．9 重组腈水合酶和酰胺酶活力的测定

6．2．10 一菌多酶偶联催化CPIN的研究

6．2．11 双菌双酶偶联催化CPIN的研究

6．2．12 双菌细胞比例对偶联催化CPIN的影响

6．3 结果与讨论

6．3．1 单质粒共表达体系的构建

6．3．2 pETDuet-N-K单质粒共表达体系的分析

6．3．3 pRSFDuet-N-K单质粒共表达体系的分析

6．3．4 pCDFDuet-N-K单质粒共表达体系的分析

6．3．5 pETDuet-N+pET-A双质粒共表达体系的分析

6．3．6 pRSFDuet-N+pET-A双质粒共表达体系的分析

6．3．7 pCDFDuet-N+pET-A双质粒共表达体系的分析

6．3．8 不同偶联催化策略的比较

6．3．9 双菌细胞量比例对偶联催化CPIN的影响

6．4 本章小结

第七章 结论与展望

7．1 结论

7．2 论文的创新点

7．3 展望

参考文献

附录

作者简介及博士期间的研究成果