转哈茨木霉双几丁质酶基因(Ech42+Nag70)提高棉花黄萎病抗性的研究

摘要

棉花黄萎病(V.Wilt)是化学药剂难以防治的土传病害之一，爆发时会严重影响棉花的纤维品质和产量。我国是棉花生产大国，主要以种植陆地棉为主。而黄萎病高抗材料主要存在于野生棉和少数海岛棉中，陆地棉中几乎没有，因此常规育种技术难以有效培育抗黄萎病的陆地棉品种。转基因技术的发展为棉花抗黄萎病育种提供了一条有效的途径。
　　本研究拟将来源于哈茨木霉的内切几丁质酶基因Ech42和外切几丁质酶Nag70，通过农杆菌活体转化技术转入中棉所49中，获得转基因植株，研究其对黄萎病病原菌的抗性。同时，为提高田间筛选的效率，选用抗草铵膦基因bar作为筛选基因，创制同时含有抗黄萎病基因和抗草胺磷基因的棉花新种质。获得的主要结果如下:
　　1.利用原载体pBIN（Ech42+Nag70）构建出含有内切几丁质酶基因Ech42和外切几丁质酶基因Nag70的双价植物表达载体载体pCAMBIA（Ech42+Nag70）。
　　2.利用农杆菌活体转化技术将植物表达载体pCAMBIA（Ech42+Nag70）导入棉花中，获得了种子T0。用10mg/L的草铵膦对T0的幼苗进行筛选，获得了转基因候选植株，并通过对候选植株进行PCR和Southern blot检测验证，最终获得了转Ech42和Nag70基因的种质系.
　　3.用大丽轮枝菌孢子悬浮液的接种试验表明，转基因植株的抗病性明显高于对照植株;同时对转基因棉花的外源胞壁降解酶活性的测定表明，转基因棉花的内、外几丁质酶的活性高于非转基因植株。
　　4.获得的转Ech42和Nag70基因棉花抗黄萎病能力有明显提升，为棉花抗黄萎病育种提供了抗性种质。

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摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1．1 棉花抗黄萎病研究

1．1．1 黄萎病的致病机理

1．1．2 棉花抗黄萎病的遗传方式

1．1．3 棉花抗黄萎病育种研究进展

1．2 棉花遗传转化常用技术

1．2．1 农杆菌介导法

1．2．2 花粉管通道法

1．2．3 基因枪法

1．3 棉花遗传转化的成就

1．3．1 转基因抗虫棉

1．3．2 转基因彩色棉

1．3．3 抗逆及品质改良转基因棉花

1．4 几丁质酶基因及其应用

1．4．1 植物几丁质酶基因

1．4．2 木霉胞壁降解酶基因

1．5 本研究的目的和意义

第二章 转哈茨木霉基因表达载体的构建

2．1 材料与方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验试剂

2．1．3 实验仪器

2．1．4 培养基及抗生素

2．1．5 实验方法

2．2 结果与分析

2．2．1 重组质粒的酶切鉴定

2．2．2 植物表达载体的PCR验证

2．3 讨论

第三章 转哈茨木霉基因棉花株系的获得

3．1 材料与方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验试剂

3．1．3 培养基

3．1．4 实验仪器

3．1．5 实验方法

3．1．6 转哈茨木霉基因Ech42和Nag70植株的PCR鉴定

3．2 结果与分析

3．2．1 草铵膦筛选转基因植株的最适浓度

3．2．2 草铵膦筛选转基因幼苗

3．2．3 抗草铵膦植株的PCR分析

3．2．4 Southern blot分析

3．3 讨论

第四章 转基因株系的抗病性鉴定

4．1 材料与方法

4．1．1 试验材料

4．1．2 仪器和试剂

4．1．3 培养基

4．1．4 转基因植株的抗病性检测

4．1．5 统计分析

4．2 结果与分析

4．2．1 转基因植株抗病性的活体检测表现

4．2．2 转基因植株抗病性的离体检测表现

4．2．3 转基因植株内切、外切几丁质酶活性的表现

4．3 讨论

参考文献