近膜区域荧光显微图像中亚细胞目标的斑点检测、融合事件识别和三维形态重建

摘要

随着光学显微技术的进步，全内反射荧光显微镜(total internal reflection fluorescencemicroscopy，TIRFM)相比于传统的生物医学研究方法（如免疫细胞化学、基因技术、亚细胞分层等）能够实时观察细胞膜附近区域内的亚细胞目标（如转运囊泡、自噬溶酶体、细胞骨架等），并定量分析其结构形态和动态运动特性（如微管结构，胞吞胞吐过程中的囊泡运动、细胞迁移等）。但由于所观察的对象特征复杂、运动模式多变，人工分析海量的TIRFM图像数据不仅十分繁琐，分析结果错误率往往较高。因此，利用计算机图像处理技术对显微图像进行自动分析，并提供客观的定量数据帮助量化并验证所观察到的生命活动就显得尤为重要。
　　细胞膜附近区域葡萄糖转运蛋白(glucose transporter，Glut)囊泡的运动情况和徽管细胞骨架的结构形态与葡萄糖转运机制密切相关。针对近膜区域内常见的Glut4囊泡、自噬溶酶体以及微管细胞骨架等亚细胞目标的TIRFM图像，本论文开展如下工作:荧光显微图像降噪，显微图像中特征斑点的检测，Glut4囊泡与细胞质膜融合过程的自动识别，以及利用多角度TIRF成像技术重建微管在近膜区域的三维形态。论文主要成果及创新点包括:
　　(1)在分析荧光显微图像形成的基础上，提出基于小波多尺度求和(wavelet multiscaleaddition，WMA)的图像降噪方法。不同信噪比的模拟图像实验结果表明相对于线性滤波，高斯平滑滤波以及小波多尺度方差稳定变换算法，WMA算法拥有更优的降噪效果。WMA算法在C2C12骨骼肌细胞Glut4囊泡和微管图像中的降噪效果也得到了验证。
　　(2)建立了根据荧光斑点的亮度均值和方差构建特征空间实现显微图像中的特征斑点检测(feature particle detection，FPD)算法。模拟图像实验结果表明在信噪比很低(SNR=1)时，FPD算法的准确检测率仍能达到87％。在胸主动脉平滑肌细胞自噬溶酶体的检测中，FPD算法优于ImageJ软件自带的Analyze articles(AP)算法，与人工识别效果的拟合度达到93％。
　　(3)基于pH值敏感性荧光蛋白VAMP2-pHluorin标记Glut4囊泡，应用移动平均差分算法结合自适应阈值（中值绝对偏差）能从TIRF图像序列中检测出备选Glut4融合囊泡并确定融合起始帧数。通过对备选Glut4融合囊泡进行逐帧二维Gaussian拟合，得到融合过程中囊泡的参数变化情况，以此判断备选Glut4囊泡融合过程属于完全融合(fullfusion)还是部分融合（partial fusion）。三组已知真实融合信息的3T3-L1脂肪细胞TIRF图像序列用于验证识别算法的有效性。实验结果表明备选Glut4融合囊泡准确检测率达到96.5％，融合过程准确识别率达到84.3％。
　　(4)结合多角度TIRF显微技术得到图像的更多空间深度信息，拟合不同入射角下激光的透射强度，实现了观察目标的三维形态重建。实验结果表明在信噪比为2时，探测深度在300nm范围内的定位精度能达到40nm。U373细胞中微管的三维形态重建结果与细胞迁移过程中细胞骨架的三维空间结构类似，符合生物学意义。
　　本论文提出的TIRF图像处理技术为定量研究细胞膜附近亚细胞目标的结构形态和动态生理活动提供了客观的数据基础，对细胞近膜区域斑点检测、融合的动态过程识别和三维形态重建具有重要的科学意义。

目录

声明

致谢

摘要

1 绪论

1．1 研究背景

1．1．1 糖尿病的致病原因及分类

1．1．2 与葡萄糖转运相关的亚细胞目标

1．1．3 近膜区域荧光显微成像技术

1．2 研究意义

1．3 研究现状

1．3．1 荧光显微图像中亚细胞荧光斑点的检测

1．3．2 囊泡与细胞质膜融合过程的识别与分类

1．3．3 基于多角度TIRF成像的亚细胞目标三维形态重建

1．4 研究内容

2 荧光显微图像的形成及噪声干扰去除

2．1 显微镜光学基础

2．2 荧光显微图像的形成

2．3 荧光显微图像中存在的噪声

2．3．1 基于设备的噪声

2．3．2 基于样本的噪声

2．3．3 基于样本准备和设备操作引入的噪声

2．4 荧光显微图像建模仿真

2．5 荧光噪声干扰去除

2．5．1 小波多尺度求和算法

2．5．2 模拟图像数据降噪实验

2．5．3 生物图像数据降噪实验

2．6 本章小结

3 显微图像中亚细胞特征斑点的检测

3．1 特征斑点检测算法

3．1．1 图像背景估计

3．1．2 目标增强

3．1．3 Meanshift优化目标位置

3．1．4 特征目标判别准则

3．2 检测方法的性能评价标准

3．2．1 F-score

3．2．2 ROC曲线

3．3 模拟图像特征斑点检测

3．4 生物图像特征斑点检测

3．5 本章小结

4 Glut4囊泡融合过程的自动识别及分类

4．1 完全融合的理想数学模型

4．1．1 完全融合的理想建模

4．1．2 融合事件区域描述符

4．1．3 融合事件的最佳匹配

4．2 Glut4融合事件识别算法

4．2．1 移动平均差分算法检测备选Glut4融合囊泡

4．2．2 Glut4融合过程的识别

4．3 实验结果

4．4 本章小结

5 多角度TIRF显微镜探测深度的标定及微管三维重建

5．1 多角度TIRF显微镜成像原理

5．2 多角度TIRF显微成像系统

5．3 多角度TIRF显微镜探测深度的标定

5．3．1 理论公式法

5．3．2 改进的斜坡法

5．4 多角度TIRF图像三维重建

5．4．1 多角度TIRF图像三维重建的挑战

5．4．2 模拟微管多角度TIRF图像的生成

5．4．3 基于拟合透射强度曲线的目标三维重建

5．4．4 不同噪声水平下的三维重建

5．4．5 最优入射角数目的选取

5．4．6 真实微管图像的三维重建

5．5 本章小结

6 总结与展望

6．1 总结

6．2 展望

参考文献

攻读博士学位期间的主要科研成果

作者简介