缺氧预处理提高间充质干细胞来源的外泌体治疗心梗疗效的机制研究

摘要

心肌梗死是危害人类健康的重大疾病，干细胞移植治疗是心肌组织修复最有前景的治疗手段之一，如何提高其修复疗效是关键问题。近年来很多研究证明移植后的干细胞主要通过旁分泌起作用，而其所分泌的外泌体(exosome)可能起到了主要的作用，将来利用干细胞分泌的exosome作为干细胞替代治疗是非常有前景的想法。预处理干细胞可以改善干细胞的生存能力，可能是通过改变细胞的表达谱来实现，同时细胞在各种不同的应激情况下其分泌的exosome亦有不同，而exosome中所携带的供体细胞来源的有益因子如蛋白质、microRNA等是发挥生物学作用的主要表现者，所以如何获得更有益的exosome来作为替代治疗是目前需要解决的问题。microRNA是一种长度大约在22个核苷酸的单链非编码RNA，通过抑制mRNA转录或促进mRNA降解来调节基因表达。其中microRNA-210是一种由HIF-1α调节的microRNA，我们发现，MSCs在缺氧条件下，miR-210的表达在细胞水平升高约10倍，并且其分泌的exosome中也增加了约25倍。然而预处理（如缺氧预处理）干细胞后是通过何种机制改变exosome表达谱至今未有报道。我们注意到Neutral sphingomyelinaseⅡ(nSMase2)对exosome的释放以及蛋白质、microRNA等经exosome的装载有一定的影响。目前nSMase2对于间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)来源的exosome的形成以及exosome表达谱的影响至今未有报道。本研究着重探讨nSMase2在MSCs缺氧预处理(Hypoxiapreconditioning，HP)后对于其exosome内microRNA表达谱的改变及其作用机制，为今后获得更有益的exosome来作为替代治疗提供新的思路。
　　目的:研究缺氧预处理MSCs来源的exosome(exosomeHP)是否具有更佳的心梗后心脏保护作用，并探讨nSMase2在调节exosome中microRNA210的作用机制。
　　方法:本研究首先比较了在常氧和缺氧条件下，MSCs分泌的exosome在数量和形态上的差异。通过BCA定量来比较总exosome的产量，结果显示常氧和缺氧下exosome的总蛋白含量无显著性差异，可以说明exosome释放的数量上没有差异;通过电镜来和Zetaszier Nano-S90仪器观察到常氧和缺氧来源的exosome在形态和粒径范围上也相似。我们进一步比较了两者的生物学效应，通过建立小鼠心梗模型，经心肌内注射分别来自于常氧和缺氧MSCs分泌的exosomes以及PBS，来观察不同处理后其对心梗后心肌修复的差异。体内实验分为四组:Sham组，PBS组，exosomecontro1组和exosome HP组，观察了心梗后3、7、14、28天的小鼠心功能，发现exosomeHP组相比PBS组和exosomecontrol组心功能明显改善。
　　结果:通过体外人脐静脉内皮细胞(HUVECs)管腔形成试验和H9C2的凋亡试验，本研究同样得出exosomeHP组具有更明显的促血管形成和抗凋亡作用。通过qPCR检测发现exosomeHP中含有更高水平的miR-210，同时体外应用miR-210mimic分别转染HUVECs和H9C2后也可观察到，与exosomeHP相似的促血管形成和抗凋亡生物学作用，表明miR-210在exosomeHP中的重要作用。进一步机制研究揭示，缺氧下的MSCs其nSMase2的表达亦有所升高，并且可能是由HIF-1α调控。所以本研究通过加用nSMase2抑制剂GW4869，观察到exosomeHP的促血管和抗凋亡作用被削弱了。研究发现经GW4869处理后缺氧MSCs分泌的exosome在总蛋白含量上没有统计学差异，而条件上清和exosome中的miR-210却降低了。
　　结论:缺氧预处理MSCs来源的exosome具有更好的心梗后心脏保护作用，miR-210可能是其中发挥生物学作用的主要表现者，而nSMase2对于miR-210经exosome的释放起了重要的调控作用。

目录

声明

致谢

摘要

缩略语

1．前言

2．材料与方法

2．1 实验材料与试剂

2．2 实验方法

3．结果

3．1 MSC鉴定以及exosome鉴定

3．2 缺氧MSCs来源的exosome可以改善小鼠心梗后心功能

3．3 缺氧MSCs来源的exosome对受体细胞的作用

3．4 缺氧对miR-210在MSCs和exosome中表达的影响

3．5 miR-210可以模拟exosomeHP的生物学作用

3．6 缺氧提高MSCs中nSMase2的表达

3．7 缺氧后miR-210经exosome的释放是呈nSMase2依赖性的

3．8 抑制nSMase2对exosomeHP生物学效应的影响

4．讨论

5．结论

参考文献

综述 干细胞治疗心肌梗死

作者简历