叶酸代谢通路抑制剂对脑胶质瘤的治疗作用及其神经毒性机制研究

摘要

本文分为以下两个部分进行探讨：
　　第一部分 DHFR/TYMS抑制剂协同替莫唑胺治疗胶质瘤的作用及机制研究
　　目的:
　　神经胶质瘤(glioma)是颅内最常见的原发性肿瘤，恶性程度高，患者死亡率高。替莫唑胺(temozolomide，TMZ)是临床治疗胶质瘤一线药物，不良反应轻，但存在严重的耐药现象，因此改善TMZ耐药和提高胶质瘤疗效成为研究热点之一。叶酸(folic acid，FA)信号通路抑制剂在胃癌、结直肠癌等癌症治疗中发挥了关键作用，但其能否提高TMZ在胶质瘤中的疗效仍有待研究。本课题主要研究叶酸代谢通路关键蛋白二氢叶酸还原酶（Dihydrofolate reductase，DHFR）和胸苷酸合成酶(thymidylate synthase，TYMS)抑制剂培美曲塞（pemetrexed，PTX）协同TMZ治疗胶质瘤的作用及其分子机制。
　　方法:
　　1.(1)Western blot法检测胶质瘤细胞U251、U87和胶质瘤样本中DHFR和TYMS的蛋白表达;(2)应用qRT-PCR.免疫组化及H&E染色技术检测人胶质瘤样本中DHFR和TYMS的表达情况。
　　2.(1)胶质瘤细胞U251、U87转染DHFR、TYMS质粒过表达或siRNA沉默DHFR和TYMS，采用western blot及细胞计数法检测DHFR/TYMS对胶质瘤细胞增殖能力的影响;(2)采用western blot、细胞计数法及BrdU掺入法检测体外给予FA激活DHFR/TYMS后对胶质瘤细胞增殖的影响;(3)AnnexinⅤ-FITC/PI结合流式细胞术检测细胞凋亡;(4)给予不同浓度FA饲料（2ppm、6ppm和40ppm）饲喂裸小鼠，并建立人源性胶质瘤U251裸小鼠移植瘤模型，检测FA对胶质瘤增殖的影响。
　　3.(1)SRB法检测沉默DHFR/TYMS后TMZ对胶质瘤细胞增殖能力的影响;(2)AnnexinⅤ-FITC/PI结合流式细胞术、western blot及DAPI染色检测细胞凋亡;(3)建立人源性胶质瘤U251裸小鼠移植瘤模型，检测药物的体内抗肿瘤作用。
　　4.(1)Western blot法检测PTX和TMZ共同作用对p-AMPK、mTOR信号及其下游因子表达情况的影响;(2)Western blot及AnnexinⅤ-FITC/PI结合流式细胞术检测抑制AMPK能否逆转PTX联合TMZ诱导的细胞凋亡。
　　结果:
　　1.DHFR/TYMS在脑胶质瘤中高表达:(1)DHFR/TYMS在胶质瘤细胞U251、U87中呈现高表达;(2)在人胶质瘤样本中DHFR/TYMS的mRNA和蛋白水平的表达量均明显高于癌旁组织。
　　2.DHFR/TYMS促进胶质瘤细胞增殖:(1)胶质瘤细胞U251和U87中过表达DHFR/TYMS质粒能够明显增加胶质瘤细胞增殖;(2)DHFR/FYMS沉默后明显抑制胶质瘤细胞增殖并诱导细胞发生凋亡;(3)体内外给予FA激活DHFR/TYMS能够明显增加胶质瘤细胞增殖。
　　3.PTX协同TMZ治疗胶质瘤:(1)DHFR/TYMS沉默或采用其抑制剂PTX均能显著增加TMZ抑制细胞增殖的作用并诱导细胞发生凋亡;(2)U251胶质瘤裸小鼠移植瘤模型中PTX与TMZ合用表现出良好的体内协同抗肿瘤作用。
　　4.PTX协同TMZ激活AMPK-mTOR信号通路:(1)PTX联合TMZ明显上调AMPK的磷酸化水平，并进一步抑制mTOR信号及下游因子的表达;(2)抑制AMPK能够逆转DHFR/TYMS抑制剂联合TMZ诱导的细胞凋亡。
　　结论:
　　本研究证实了叶酸代谢通路关键蛋白TYMS/DHFR高表达于胶质瘤中，过表达DHFR/TYMS可明显促进人胶质瘤细胞的增殖，其抑制剂PTX协同TMZ诱导细胞凋亡。我们还发现AMPK-mTOR信号通路在PTX协同TMZ抗胶质瘤过程中发挥了重要作用，并且沉默AMPK可有效逆转PTX协同TMZ诱导的细胞凋亡。综上所述，本研究阐明了DHFR/TYMS抑制剂PTX协同TMZ治疗胶质瘤的作用，并明确了AMPK-mTOR信号通路在其中的重要角色，为临床提高胶质瘤疗效、改善TMZ耐药提供了理论依据。
　　第二部分 TYMS抑制剂5-氟尿嘧啶的神经毒性及机制研究
　　目的:
　　TYMS抑制剂5-氟尿嘧啶(5-FU)是临床广泛使用的一线抗肿瘤药物，主要治疗成年病人常见肿瘤，并在近年来逐步应用于儿童肿瘤。临床研究发现治疗成年肿瘤患者可导致中枢神经系统内脑白质脱髓鞘综合征，但儿童中5-FU对白质损伤及其分子机制仍未阐明。本课题研究5-FU导致幼年小鼠神经毒性的分子机制，并且研究损伤修复过程中的关键蛋白。
　　方法:
　　1.(1)幼年小鼠给予5-FU作用4天，采用免疫荧光及免疫组化技术检测5-FU对少突胶质细胞、神经元和星形胶质细胞的影响;(2)应用qRT-PCR评价5-FU对脑、脊髓中少突胶质细胞标记物表达的影响;(3)采用透射电镜技术评价5-FU对髓鞘完整性的影响。
　　2.(1)免疫荧光技术检测5-FU作用后对幼年小鼠中少突胶质细胞增殖和分化情况的影响;(2)Western blot和TUNEL法检测5-FU对少突胶质细胞凋亡的影响。
　　3.(1)Microarray技术检测5-FU作用后小鼠脊髓中髓鞘相关基因、少突胶质细胞的正向及负向调控因子的变化，并对数据进行GO分析细胞成分和生物学过程相关基因的变化;(2)免疫荧光技术检测TCF7L2在少突胶质细胞中的表达情况;(3)Western blot、qRT-PCR和免疫荧光技术检测5-FU作用后幼年小鼠脑和脊髓中TCF7L2的变化情况。
　　4.(1)原代培养少突胶质细胞并诱导分化，采用免疫荧光技术检测HDAC1/2在少突胶质细胞中的表达情况;(2)免疫共沉淀法检测TCF7L2与HDAC1/2的相互关系;(3)采用qRT-PCR检测过表达TCF7L2，HDAC1/2对于5-FU诱导的少突胶质细胞损伤的逆转作用。
　　5.(1)免疫组化法检测5-FU对成年及幼年小鼠少突胶质细胞标记物MBP的表达情况;(2)采用透射电镜技术评价5-FU对髓鞘完整性的影响。
　　6.(1)免疫荧光检测5-FU损伤后TCF7L2在成年及幼年小鼠脑胼胝体区域的表达情况;(2)采用免疫荧光检测Oli-Neu及原代培养的少突胶质细胞中过表达TCF7L2后细胞增殖和分化的情况;(3)应用qRT-PCR检测Oli-Neu细胞中过表达TCF7L2或其抑制形式TCF7L2-EN后细胞增殖的情况。
　　结果:
　　1.5-FU引起中枢神经系统脱髓鞘:(1)幼年小鼠给予5-FU后明显减少少突胶质细胞系标记物Olig2、成熟标记物MBP的表达，而对神经元标记物NeuN和星形胶质细胞标记物GFAP的表达并未产生明显影响;(2)5-FU作用后的小鼠髓鞘明显变薄，且包裹较松散，出现脱髓鞘现象。
　　2.5-FU诱导少突胶质细胞发生凋亡。
　　3.5-FU明显下调Wnt信号通路效应因子TCF7L2的表达:(1)5-FU作用后小鼠脊髓中髓鞘相关基因、少突胶质细胞的正向调控因子明显下调，并发现Wnt信号通路效应因子TCF7L2也明显下调;(2)TCF7L2可以在少突胶质细胞中表达，在给予5-FU作用后，小鼠脑和脊髓中TCF7L2的表达明显下调;Western blot及qRT-PCR检测结果也表明，5-FU作用后TCF7L2的蛋白和mRNA水平显著下调。
　　4.5-FU干扰TCF7L2/HDAC1/2复合物的形成:(1)HDAC1和HDAC2均表达于原代培养的少突胶质细胞中;免疫共沉淀法检测发现在小鼠的脑皮层组织中，内源性的TCF7L2与HDAC1、HDAC2三者结合;(2)在原代培养的少突胶质细胞中发现5-FU作用后显著下调TCF7L2、HDAC1和HDAC2的表达，从而破坏了TCF7L2和HDAC1/2的结合。
　　5.成年小鼠及幼年小鼠中的脱髓鞘再生现象:(1)成年小鼠在损伤后的第1天(day post lesion，dpl)MBP有轻微下调，而在8dpl时MBP表达明显下调;透射电镜下发现在1dpl，轴突形态明显拉长，而在8dpl，髓鞘明显减少。在22dpl时MBP的表达相较于8dpl明显上调;(2)在幼年小鼠中，1dpl少突胶质细胞标记物MBP明显下调，5dpl损伤组中可见MBP表达开始出现，到损伤的第22天，MBP表达明显增多。
　　6.TCF7L2在幼年小鼠损伤后修复过程中被激活。
　　结论:
　　本研究揭示5-FU通过诱导少突胶质细胞凋亡而对幼年小鼠产生中枢神经系统毒性。在脱髓鞘修复过程中，幼年小鼠的恢复时间明显短于成年小鼠。进一步的研究表明，TCF7L2参与到了5-FU导致的脱髓鞘及髓鞘再生过程中。5-FU通过影响TCF7L2/HDAC1/2复合物的形成从而导致少突胶质细胞死亡。该研究开展为5-FU在儿童中的临床合理使用提供了理论依据，并揭示了TCF7L2在5-FU引起的脱髓鞘/再髓鞘化过程中的作用和地位，提供了新的再髓鞘化机理和分子靶点，为进一步推动防治脱髓鞘损伤和促髓鞘化药物的设计和开发提供了新的思路。

目录

声明

致谢

摘要

第一部分 DHFR／TYMS抑制剂协同替莫唑胺治疗胶质瘤的作用及机制研究

1．1 引言

1．2 实验材料与仪器

1．2．1 细胞株和原代样本

1．2．2 实验动物

1．2．3 药物

1．2．4 试剂

1．2．5 相关试剂的配置

1．2．6 实验仪器

1．3 实验方法

1．3．1 细胞培养

1．3．2 SRB染色法测定肿瘤细胞的增殖活性

1．3．3 siRNA技术沉默人胶质瘤细胞U87／U251中的TYMS和DHFR

1．3．4 DAPI染色检测细胞凋亡

1．3．6 Western blot检测蛋白的表达情况

1．3．7 质粒转染技术

1．3．8 Real-time PCR测定细胞相关基因表达水平的变化

1．3．9 BrdU掺入及免疫荧光

1．3．10 免疫组化(石蜡切片)

1．3．11 人胶质瘤细胞U251裸小鼠移植瘤模型建立及实验

1．3．12 TUNEL法检测细胞凋亡

1．3．13 数据分析

1．4 实验结果

1．4．1 DHFR／TYMS高表达于胶质瘤细胞和患者肿瘤组织

1．4．2 DHFR／TYMS促进胶质瘤细胞的增值

1．4．3 抑制DHFR／TYMS促进TMZ对U251和U87细胞的增殖抑制作用

1．4．4 PTX协同TMZ激活AMPK-mTOR信号通路

1．5 讨论

第二部分 TYMS抑制剂5-FU导致的神经毒性及机制研究

2．1 引言

2．2 实验材料与仪器

2．2．1 实验仪器

2．2．2 细胞株和实验动物

2．2．3 药物与试剂

2．2．4 Western blot实验相关试剂的配制

2．2．5 实验仪器

2．3 实验方法

2．3．1 细胞培养

2．3．2 OPC的纯化和分化

2．3．3 组织和细胞免疫荧光

2．3．4 组织免疫组化(冰冻切片)

2．3．5 Real-Time PCR

2．3．6 透射电镜和g-ratio分析

2．3．7 Western blot

2．3．8 质粒转染

2．3．9 荧光素酶报告基因

2．3．10 数据分析

2．4 实验结果

2．4．1 5-FU引起少突胶质细胞损伤

2．4．2 5-FU引起中枢神经系统脱髓鞘现象

2．4．3 5-FU不影响少突胶质细胞的分化

2．4．4 5-FU明显减少少突胶质前体细胞的表达

2．4．5 5-FU不引起少突胶质细胞的增殖变化

2．4．6 5-FU引起少突胶质细胞的凋亡

2．4．7 5-FU抑制转录因子TCF7L2的表达

2．4．8 5-FU干扰TCF7L2／HDAC1／2复合物的形成

2．4．9 成年小鼠中的脱髓鞘再生现象

2．4．10 幼年小鼠中5-FU引起的中枢神经系统脱髓鞘再生现象

2．4．11 TCF7L2在损伤后修复过程中被激活

2．4．12 TCF7L2促进少突胶质细胞的增值和分化

2．5 讨论

参考文献

综述

作者简介及在读期间取得的科研成果