Sox9调控肝癌干细胞对称/非对称分裂影响自我更新及肿瘤发生的研究

摘要

肝癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)一类危害严重的常见恶性消化道肿瘤之一，全球发病率居恶性肿瘤第五位，死亡率居第三位。目前，对早期肝癌最好的治疗方式是肝切除和射频消融。然而，肝癌患者术后或射频消融后容易复发，并且对放疗、化疗易产生耐药性，患者预后较差。因此，深入研究肝癌的发生、发展及复发的分子机制，并寻找新的诊断分子标志物，对肝癌的预防、早期诊断和个体化治疗以及患者生存质量的提升均具有重要的意义。
　　最新的研究表明，在肿瘤中存在一小群具有干细胞样特征的细胞亚群，具有无限增殖、自我更新、浸润性表型、高致瘤性的特征，因此被称为肿瘤干细胞(CancerStem Cells，CSCs)或肿瘤起始细胞(Tumor Initiating Cells，TICs)。目前研究表明，肿瘤干细胞具有耐放化疗，是术后复发和转移的根源。因此，阐明肝癌干细胞自我更新的分子机制，针对性开发杀伤肝癌干细胞的治疗方法成为当前肝癌研究的重点。课题组在前期的研究中，已成功地建立了以多能转录因子-Nanog为标记的肝癌干细胞筛选模型，然而调控肝癌干细胞自我更新的内在分子机制还有待进一步研究。
　　Sox9(Sex Determining Region Y-Box9)是一种重要的胚胎早期发育相关基因，是SoxE家族的重要成员之一。Sox9基因定位于染色体17q24.3～25.1区段内，长度约为3934bp，含有两个内含子，是第一个被报道含有内含子的Sox基因。既往的研究证实，Sox9在肿瘤发生、发展中具有重要作用，扮演着癌基因的角色，在肿瘤组织中的表达升高与病人的预后不良密切相关，如肝癌、结肠癌等。研究表明，Sox9和Slug协同促进人乳腺癌的转移，导致乳腺癌患者生存率下降;而EMT的发生往往伴随着肿瘤干细胞的产生。在小鼠肝癌模型中，Notch信号通路的异常激活可促进小鼠肝癌的发生，同时伴随着Sox9的异常表达。前期，课题组在研究肿瘤干细胞和非肿瘤干细胞动态变化时发现，Notch信号通路的活化在肿瘤干细胞自我更新中发挥着重要作用。新近研究表明，在小鼠的基底细胞癌模型中，Sox9通过影响细胞的对称分裂和转录调控下游靶基因的表达调控肿瘤干细胞的自我更新。
　　基于以上文献回顾和前期研究基础，我们提出研究假设:(1)Sox9是否参与肝癌干细胞自我更新的维持及肿瘤的发生？(2)对称/非对称分裂是否参与调控肝癌干细胞自我更新及肿瘤的发生？(3)Sox9是否影响肝癌干细胞对称/非对称分裂进而调控肝癌干细胞自我更新及肿瘤的发生，及分子机制是怎样的？据此，本课题致力研究和探讨Sox9调控肝癌干细胞对称/非对称分裂影响自我更新及肿瘤发生的作用及分子机制。
　　1.Sox9在肝癌干细胞中的表达及对增殖能力和“干性”的影响
　　我们运用课题组前期构建的多能转录因子-Nanog为标记的肝癌干细胞筛选模型，采用流式细胞仪分选出肝癌干细胞(NanogPositive)和非肝癌干细胞（NanogNegative）两个亚群的细胞，通过western blotting和免疫荧光的方法检测Sox9在不同亚群中的表达差异。进一步将分选出的肝癌干细胞和非肝癌细胞采用皮下注射NOD/SCID小鼠，肿瘤长至合适大小(＜2cm)时，处死小鼠并取相应的肿瘤组织提取蛋白和制备免疫组化切片，通过western blotting和免疫组织化学的方法检测Sox9的表达情况。同时，运用western blotting和免疫组织化学方法对175例肝癌患者中的肿瘤组织及相对应的癌旁组织检测Sox9蛋白表达水平。研究结果表明，与非肝癌干细胞相比较，Sox9在肝癌干细胞中是异常高表达的。通过对临床肝癌组织样品检测分析发现，与癌旁组织相比较，Sox9在肝癌组织中是异常高表达的，并且高表达Sox9的肝癌患者预后较差，低表达Sox9的肝癌患者预后较好。
　　为验证Sox9在肝癌干细胞“干性”维持上具有重要的生物学功能，我构建了干扰Sox9的shRNA慢病毒质粒，通过细胞增殖，Ki-67免疫荧光染色，细胞周期分析发现，下调Sox9表达可显著抑制肝癌干细胞的增殖能力。通过western blotting检测“干性”相关基因发现，下调Sox9表达可显著抑制“干性”相关基因的表达，同时促进分化基因的表达。
　　为进一步研究Sox9对肝癌干细胞自我更新和体内成瘤能力的影响，我们采用流式细胞仪分选出肝癌干细胞和非肝癌干细胞，1)在肝癌干细胞中感染shSox9的慢病毒及对照慢病毒，通过细胞克隆，细胞成球及NOD/SCID小鼠体内成瘤，检测敲低Sox9对肝癌干细胞自我更新及体内成瘤能力的影响;2)在非肝癌干细胞中过表达Sox9，通过细胞克隆，细胞成球及NOD/SCID小鼠体内成瘤，检测过表达Sox9对非肝癌干细胞自我更新及体内成瘤能力的影响。以上结果证实，Sox9对肝癌干细胞增殖、自我更新、肿瘤形成等“干性”特征的维持方面扮演着重要的角色。
　　2.肝癌干细胞对称/非对称分裂调控肿瘤的发生、发展通过BrdU标记、细胞配对及成球培养和10％ FB S/DMEM两种培养的方法进行肝癌干细胞对称/非对称分裂的研究。研究发现，与10％ FBS/DMEM细胞培养条件相比，成球培养条件下的肝癌干细胞能保持更强的“干性”特征及肿瘤形成能力。通过将流式细胞仪分选出的肝癌干细胞在两种培养条件下进行培养，免疫荧光检测分析发现，与10％ FBS/DMEM细胞培养条件相比，在成球培养条件下，肝癌干细胞发生对称分裂的比例显著升高。我们前期研究发现，Notch信号通路在维持肝癌干细胞自我更新及肿瘤形成具有重要的作用，而在肝癌干细胞中加入Notch信号通路的抑制剂处理后可降低肿瘤的形成及非对称分裂的增加。同时发现Notch信号通路的负调控因子-Numb的表达也发生改变。以上结果表明，肝癌干细胞通过调控对称/非对称分裂影响肿瘤的发生、发展。
　　3.Sox9通过调控Notch信号通路的负调控因子-Numb影响肝癌干细胞的对称/非对称分裂
　　为进一步研究Sox9调控肝癌干细胞对称/非对称分裂影响肿瘤的发生、发展，并阐明其调控的分子机制，我们首先通过免疫荧光检测Sox9与BrdU的共定位情况。我们发现Sox9与BrdU具有很好的共定位。在肝癌干细胞中敲低Sox9，与对照组相比，敲低Sox9后肝癌干细胞的对称分裂比例显著下降，而非对称分裂比例显著升高，提示Sox9可能通过影响肝癌干细胞对称/非对称分裂进而使“干性”特征发生变化。
　　进一步研究发现，在肝癌干细胞中加入Notch信号通路的抑制剂同时过表达Sox9，可逆转因Notch信号通路失活而导致的肿瘤生长能力及对称分裂比例的下降。已有研究表明，Notch信号通路的负调控因子-Numb可作为细胞对称/非对称分裂的检测指标之一，我们在研究肝癌干细胞对称/非对称分裂时也得到了一致的结果;在肝癌干细胞中敲低Sox9，发现Numb在子代细胞中表达比例显著增高;Western blotting证实Numb在非肝癌干细胞中高表达，且Sox9可调控Numb的蛋白表达水平。临床肝癌组织标本检测分析发现，Sox9与Numb表达存在负相关;临床预后统计发现Sox9LowNumbHigh的肝癌患者预后较好，Sox9HighNumbLow的肝癌患者预后较差。
　　综合以上Sox9在肝癌干细胞自我更新及肿瘤发生中的作用和Sox9通过调控Notch信号通路的负调控因子-Numb影响对称/非对称分裂的分子机制探究及在临床中的意义研究，我们得出以下结论:
　　1.Sox9在肝癌干细胞中异常高表达。Sox9表达高低与患者的预后密切相关，高表达Sox9的肝癌患者预后较差，低表达Sox9的肝癌患者预后较好。
　　2.Sox9可调控肝癌干细胞自我更新及肿瘤的形成能力。
　　3.肝癌干细胞的对称/非对称分裂影响肿瘤形成及“干性”特征的维持。
　　4.Sox9可调控Notch信号通路的负调控因子-Numb的表达影响肝癌干细胞对称/非对称分裂及“干性”特征的维持;临床肝癌组织标本分析，Sox9HighNumbLow的肝癌病人预后较差。

目录

声明

致谢

摘要

缩略语

1 引言

2 仪器设备和试剂

2．1 仪器设备

2．2 主要生物化学试剂

3 缓冲液和培养液的配制方法

3．1 细胞培养液

3．2 蛋白免疫印记缓冲液

3．3 免疫荧光缓冲液

3．4 ChIP试剂配制

4 Sox9在肝癌干细胞中的表达及对增殖能力和“干性”的影响

4．1 材料和方法

4．2 实验结果

4．3 讨论

5 Sox9对肝癌干细胞自我更新及肿瘤形成能力的影响

5．1 材料和方法

5．2 实验结果

5．3 讨论

6 肝癌干细胞对称／非对称分裂调控肿瘤的发生、发展

6．1 材料和方法

6．2 实验结果

6．3 讨论

7．Sox9调控Notch信号通路的负调控因子-Numb影响肝癌干细胞的对称月E对称分裂

7．1 材料和方法

7．2 实验结果

7．3 讨论

8 结论

参考文献

综述 肿瘤微环境在肿瘤干细胞中自我更新中的作用

作者简历及在读期间所取得科研成果