基于生物大分子材料的肝脏组织工程学研究

摘要

肝移植是目前发生肝功能衰竭病人的最好治疗途径，但是由于受到器官短缺的限制，且医疗费用高昂，需要终身抑制免疫功能，因此肝移植难以受惠于更多肝病患者。基于干细胞和生物材料在器官再生方面的迅速发展，寻找合适的生物材料编织成一种可支撑干细胞的支架是目前肝脏组织工程学需解决的科学问题。HCCs的合成基于胶原蛋白和壳聚糖的交联作用，联合HGF后进一步分析材料学综合特性。AFP，ALB和HNF4a基因表达量用于分析BMSCs的分化情况;Periodic-schiff染色用于评估糖原合成;CK18和ALB的免疫荧光检测评估干细胞分化程度。本实验进一步开展了搭载HGF的HCCs联合BMSCs动物体内移植实验。观察了移植组织CK18免疫组化和CK19免疫荧光。检测术后两周移植组织ALB，CYP2C9及UGT2的含量。
　　第二部分实验中利用3D生物打印机编织了一种3D肝实质细胞-水凝胶支架进行肝脏组织工程学研究。3D水凝胶在体外实验中被检测到具有良好的生物相容性。在SD大鼠体内开展移植实验，对照组，水凝胶组，水凝胶+HL-7702细胞和水凝胶+HGF分别被植入行可致死量的3/4大部分肝脏切除后的大鼠肝脏内。术后1天、5天、10天检测不同组别大鼠血清ALT，ALB，AST及总胆红素含量，进行移植组织中CYP1A2，CYP2C9，a-GST和UGT-2含量进行比较。2周后观察移植组织形态。移植组织取材后行H.E.染色，免疫组化CK18和Ckit进行观察比较。比较各组大鼠生存曲线变化情况。
　　第三部分实验中利用3D生物打印机编织了一种3D分化的骨髓间充质干细胞-水凝胶支架进行肝脏组织工程学研究。利用3D生物打印技术在三维环境下规则种植和培养分化骨髓间充质干细胞，在水凝胶的帮助下在体外形成类似肝脏三维结构形态，可持续发挥肝脏所特有的功能。qPCR用于检测干细胞分化后ALB，HNF4a和AFP的表达;Periodic-Schiff染色用于评价干细胞分化后糖原的合成;CK18免疫荧光染色观察细胞分化程度。MTT评价水凝胶3D生物打印后的生物相容性。在3天、7天和10天检测打印组织的体外合成GST，ALB和CYP2C9水平。最后将3D打印组织进行SD大鼠皮下移植进行体内实验。分别在2周和4周定量检测移植组织中ALB，CYP2C9和GST的含量。分别在2周和4周检测不同组别中的ALB、AFP和HNF4a的mRNA表达量。各组移植组织在2周和4周分别取材后行免疫组化CK18和Ckit进行观察比较。傅立叶红外光谱，热重分析，降解速率测定，力学分析和溶胀分析结果表明本实验所用的合成材料性能良好。干细胞分化后AFP，ALB和HNF4a的mRNA表达量显著增高，糖原合成显著增多，CK18表达显著增强。移植组织切片在偏振光显微镜下观察到有新生组织，CK19免疫组化、CK18免疫荧光表达阳性。ALB，CYP2C9和UGT2的含量在搭载干细胞组中表达显著增多。3D生物打印细胞-水凝胶支架并不影响细胞的活力。植入3D打印肝脏组织后，血清ALT，ALB，AST及总胆红素，移植组织中CYP1A2，CYP2C9，a-GST和UGT-2的水平发生显著改善(p＜0.05)。移植组织的H.E.染色，免疫组化CK18和Ckit进行观察发现3D打印组可形成形态规则，结构清晰可见的肝脏微单元。各组大鼠的生存曲线比较发现3D打印组的中位生存期要好于其余各组且有统计学差异(p＜0.05）。骨髓间充质干细胞分化培养后ALB、HNF4a和AFP的mRNA表达量变化显著改变，具有统计学差异(p＜0.05）。分化后CK18表达阳性，PSA染色阳性。三维打印与二维培养、混合培养的生物相容性比较无统计学差异。3D打印后ALB、GST和CYP2C9的含量在植入3天，7天和10天明显改善(p＜0.05)。经3D打印后再生的肝脏微单元形态规则，结构清晰可见。移植组织中ALB、AFP和HNF4A的mRNA表达量明显改善。体内实验结果3D打印组的ALB、GST和CYP2C9的含量在2周及4周与对照组相比明显改善(P＜0.05)。搭载肝细胞生长因子的胶原壳聚糖支架联合骨髓间充质干细胞在体内移植后形态规则，结构完整，可持续稳定发挥肝脏特殊功能。3D生物打印肝实质细胞及分化的骨髓间充质干细胞可重建肝脏类似组织，是具有潜力的一种肝脏再生方式并且具有巨大的潜力改善肝功能以及用于肝脏体外疾病模型的研究。

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致谢

摘要

缩略词表

序言

第一部分 缓释肝细胞生长因子的胶原／壳聚糖支架搭载骨髓间充质干细胞用于肝脏组织工程的应用研究

1 介绍

2 材料和方法

2．1 生物支架合成

2．2 材料特征分析

2．3 细胞培养

2．4 细胞分化

2．5 细胞搭载和活力检测

2．6 体内实验

2．7 数据统计分析

3 结果

3．1 支架

3．2 细胞分化和活力检测

3．3 体内实验

4 讨论

5 结论

6 附图

参考文献

第二部分 3D生物打印人类肝细胞再生肝脏微单元研究

1 介绍

2 材料和方法

2．1 细胞培养

2．2 细胞增殖

2．3 水凝胶支架的制备

2．4 3D打印

2．5 动物试验

2．6 数据分析

3 结果

3．1 生物相容性

3．2 形态学观察

3．3 肝功能评估

3．4 生存分析

4 讨论

5 结论

6 附图

参考文献

第三部分 3D生物打印分化骨髓间充质干细胞再生肝脏微单元研究

1 介绍

2 材料和方法

2．1 水凝胶支架

2．2 细胞培养

2．3 干细胞分化

2．4 3D打印

2．5 混合细胞培养

2．6 打印细胞培养

2．7 3D打印组织体外试验

2．8 3D打印组织体内试验

2．9 数据分析

3 结果

3．1 干细胞分化

3．2 3D打印

3．3 细胞增殖

3．4 3D打印组织的体外功能

3．5 三维打印组织的体内功能

4 讨论

5 结论

6 附图

参考文献

综述 干细胞在肝脏疾病应用中的基础研究

作者简历及在学期间所取得的科研成果