志贺氏菌效应蛋白OspI催化泛素结合酶Ubc13脱酰胺化的分子机制

摘要

病原菌在感染宿主细胞过程中，分泌大量的效应蛋白进入宿主细胞，特异性作用于宿主细胞中的关键信号分子，促进病原菌的入侵与增殖。OspI是志贺氏菌三型分泌系统分泌的效应蛋白，与宿主的泛素结合酶Ubc13相互作用，催化后者的第100位的谷氨酰胺脱酰胺化生成谷氨酸，阻碍Ubc13和泛素连接酶TRAF6合成K63多聚泛素链，抑制NF-κB免疫信号通路的激活。
　　为了研究OspI催化Ubc13脱酰胺化的分子机制，我们纯化了OspI和Ubc13并筛选到了复合物晶体，最终获得了分辨率高达2.3埃的复合物晶体结构。在复合物结构中，OspI采用木瓜蛋白酶样构象，而Ubc13采用经典泛素结合酶UBC构象。Ubc13与OspI之间存在广泛的相互作用，Ubc13的α1螺旋与OspI的负电荷区域相互作用，L1和L2无规则卷曲结合OspI的疏水区域。生化实验显示参与OspI和Ubc13结合的氨基酸的突变影响两者的相互作用并抑制NF-κB信号通路的激活。
　　结合Ubc13的OspI暴露原本被Asn61所覆盖的催化口袋，使得Ubc13的Gln100进入催化中心。因此，Ubc13结合引起的OspI的显著构象变化参与脱酰胺化反应。在OspI的催化口袋中，Asp160通过与His145的氢键相互作用，使得Cys62与His145形成硫醇咪唑离子对，激活Cys62。活化的Cys62进攻Ubc13的Gln100，使之脱酰胺化生成谷氨酸。
　　OspI作为脱酰胺酶，特异性地识别Ubc13作为底物，其中位于Ubc13的α1螺旋和L2无规则卷曲上的氨基酸是OspI特异性识别底物的决定因素。宿主去泛素化酶OTUB1和一些宿主泛素连接酶也结合Ubc13的α1螺旋，L1和L2无规则卷曲，这表明宿主蛋白和OspI识别底物的同一作用面。
　　本文揭示了OspI催化Ubc13脱酰胺化的分子机制以及宿主蛋白和病原菌蛋白在泛素结合酶的识别上的共性。

目录

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致谢

摘要

插图清单

附表清单

缩写汇总

1 引言

1．1 志贺氏菌研究现状

1．1．1 志贺氏菌的发现与分类

1．1．2 志贺氏菌病以及其危害

1．1．3 志贺氏菌的致病机理

1．1．4 志贺氏菌入侵肠道上皮相关蛋白

1．2 志贺氏菌三型分泌系统

1．2．1 志贺氏菌三型分泌系统

1．2．2 志贺氏菌三型分泌系统效应蛋白

1．3 志贺氏菌效应蛋白OspI和NF-κB信号通路

1．3．1 泛素化

1．3．2 泛素结合酶

1．3．3 NF-κB信号通路

1．3．4 志贺氏菌效应蛋白OspI

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验试剂

2．2．1 分子克隆

2．2．2 蛋白质表达与纯化

2．2．3 蛋白结晶与优化

2．3 实验方法

2．3．1 载体构建

2．3．2 蛋白表达及纯化

2．3．3 蛋白结晶与结构解析

2．3．4 生化以及细胞实验

3 结果与讨论

3．1 蛋白表达与纯化

3．1．1 OspI-C62A的表达与纯化

3．1．2 Ubc13的表达与纯化

3．2 复合物蛋白质的结晶与数据处理

3．2．1 复合物蛋白质的结晶与优化

3．2．2 复合物蛋白晶体的数据收集与处理

3．3 OspI和Ubc13复合物晶体结构

3．3．1 OspI和Ubc13复合物晶体

3．3．2 OspI和Ubc13之间的相互作用

3．3．3 OspI-Ubc13相互作用氨基酸突变实验

3．3．4 OspI的催化口袋以及构象改变

3．3．5 OspI特异性识别Ubc13

3．3．6 OspI与宿主蛋白结合Ubc13的同一作用面

3．3．7 OspI阻止TRAF6结合Ubc13

3．3．8 比较不同病原菌的脱酰胺酶结构

3．4 讨论

参考文献

作者简历