银杏东西谱系分化机制研究——基于叶绿体基因组和比较转录组方法

摘要

银杏属植物(Ginkgo spp.)在中生代侏罗纪曾广泛分布于北半球，但自中新世以来，陆续在北美、欧洲、东亚日本等地灭绝，仅在我国长江中下游地区残存了银杏(Ginkgo bilobaLinn.)的少数种群，这些种群分化为两个遗传谱系，分别分布于中国东部（以浙江天目山为代表）和中西部（以贵州务川、重庆金佛、湖北恩施等为代表）。但是由于传统分子标记的信息量不足和进化中性，银杏的谱系分化格局、分化时间及其进化动力尚未得到很好解决。因此，本文在实验室前期工作基础上，选择银杏10个代表性cpDNA单倍型个体，进行叶绿体基因组的高通量测序，基于高分辨的信息位点，解析银杏遗传谱系的分化格局及其系统发育关系，并估算谱系分化的时间;同时，通过银杏东亚分布区的生态位重建(ENM)和东、西地理谱系代表性种群（天目山和金佛山）的环境因子对比分析，鉴定主效性和差异性环境因子，进而开展这两个代表性种群的比较转录组分析，旨在检验是否存在环境分化选择，并鉴定受选择的候选功能基因。结果如下，
　　1.叶绿体基因组结构进化:银杏叶绿体基因组长度为156，929-156，999 bp，长单拷贝区(LSC区)长度为99，202-99，269 bp，短单拷贝区(SSS区)长度为22，256--22，283 bp，两个反向重复区(IR区)总长为35，464-35，466 bp，长度差异不大。插入缺失(Insertion/Deletion，indels)变异主要发生在两个单拷贝区域，而反向重复区仅相差一个碱基的变化。共鉴定了152个变异区域，包括115个SNP位点和37个Indel位点;并鉴定了5个多重复单元的EST-SSR位点为西部种群所特有，并对其设计引物，可用于后续种源鉴定分析。
　　2.遗传谱系的系统发育关系及分化时间:供试10个cpDNA单倍型的叶绿体基因组共分成三个高支持率的支系，即东部避难所支系、西部避难所支系以及广布的H1单倍型支系，西部支系首先分化。支持我们前期提出的东、西两大“避难所”假说，并进一步揭示了其形成的两次谱系分化事件。基于53个cpDNA基因、4个苏铁类化石校正点，估算得到银杏西部支系首先发生分化的时间为1.072 Mya(95％ HPD:0.2740-2.312)，东部支系与H1支系的分化时间为0.6920 Mya(95％ HPD:0.1730-1.459)。
　　3.地理分布的主效性和差异性环境因子:ENM的结果显示，影响银杏分布的主要环境因子为水分和低温。同时，金佛山与天目山气候因子（近50年数据）的T检验分析结果表明，两地在最高温度、降水量以及日照时间等因子上存在显著性差异（P＜0.05），暗示环境分化选择为可能在东西谱系分化起到作用。
　　4.环境分化选择的候选基因:转录组数据拼接得到59，585个unigenes、46，133个注释基因，东西部谱系差异表达基因9114个，GO分类注释结果揭示这些基因主要与生物学过程、细胞组分、分子功能相关的基因。以毛果杨、水稻、拟南芬和葡萄为参考基因组，在银杏中共找到141个长度大于600 bp的单拷贝核基因，其中表达差异2倍以上的有18个，并且都是天目山个体中的表达量大于金佛山个体。Ka/Ks比分析表明，528个单拷贝核基因受到了正向选择作用(Ka/Ks＞1)，其中15个与温度和水分响应相关，是受选择的候选功能基因。
　　因此，本文揭示了银杏天然种群存在3个遗传谱系，其分化始于更新世(1.072 Mya，95％HPD:0.274-2.312);谱系分化的驱动力除了遗传漂变，可能还涉及环境分化选择，选择压主要是环境温度和湿度。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 银杏种群传与谱系分化的研究进展

1．1．1 银杏“避难所”种群的探寻

1．1．2 银杏遗传谱系的地理格局、成因和进化过程

1．1．3 银杏谱系分化研究存在的问题

1．2 二代测序技术在植物谱系分化研究中的应用

1．2．1 叶绿体基因组在植物谱系分化研究中的应用

1．2．2 转录组在谱系分化研究中的应用

1．3 研究目的和内容

第二章 银杏叶绿体基因组结构分析及谱系特异性引物开发

2．1 材料与方法

2．1．1 实验材料与数据

2．1．2 仪器和试剂

2．1．3 实验方法

2．2 结果

2．2．1 银杏10个叶绿体单倍型基因组序列拼接

2．2．2 叶绿体基因组基因注释

2．2．3 银杏10个叶绿体基因组单倍型的SNP和indels

2．2．4 银杏叶绿体单倍型基因组中的SSR查找与引物设计

2．3 讨论

2．3．1 银杏叶绿体基因组重测序结果的质量分析

2．3．2 银杏10个叶绿体单倍型基因组的结构比较

2．3．3 银杏10个叶绿体单倍型基因序列进化

2．3．4 SSR标记差异

第三章 银杏东西部谱系分化式样及其分化时间计算

3．1 材料与方法

3．1．1 实验数据获得

3．1．2 仪器和试剂

3．1．3 实验数据分析

3．2 结果与分析

3．2．1 银杏10个单倍型叶绿体基因组系统发育关系树的重建

3．2．2 银杏10个单倍型叶绿体基因组系统发育关系网络图的重楚

3．2．3 银杏在裸子植物系统发育树中的位置

3．2．4 银杏单倍型谱系分化时间计算

3．3 讨论

3．3．1 谱系分化格局及H1分支的进-化位置

3．3．2 谱系分化时间

第四章 银杏分布区环境因子比较以及生态位重建

4．1 材料与方法

4．1．1 天目山和金佛山的气候环境概况

4．1．2 近50年来两地环境因子数据收集与差异比较

4．1．3 银杏ENM生态位重建

4．2 结果

4．2．1 天目山与金佛山近50年环境因子的差异比较

4．2．2 不同时期的生态位模型模拟

4．3．3 因子贡献度分析

4．3 讨论

4．3．1 影响银杏分布的主导性环境因子和金佛山、天目山两地差异性环境因子

4．3．2 银杏的分布区变化

第五章 银杏东西谱系的比较转录组分析

5．1 材料与方法

5．1．1 材料

5．1．2 仪器设备

5．1．3 方法

5．2 结果与分析

5．2．1 银杏东西谱系转录组的测序和拼接

5．2．2 银杏东西谱系转录组功能注释和分类

5．2．3 表达差异分析

5．2．4 SSR引物标记开发设计

5．2．4 银杏的单拷贝核基因挑选

5．2．5 选择作用Ka／Ks计算

5．3 讨论

5．3．1 Illumina测序与454测序的比较

5．3．2 挖掘与环境因子相关的基因

5．3．3 EST-SSRs的筛选和单拷贝基因

5．3．4 代谢途径相关的功能基因

第六章 总结与展望

附录

致谢

参考文献