水稻叶绿素含量QTL qFCC7L的精细定位&叶色控制基因WSL12的克隆与功能分析

摘要

水稻产量在很大程度上取决于光合作用速率的高低。叶绿素含量与光合作用速率在一定范围内成正相关关系。因此，探讨叶绿素含量的分子遗传机制十分重要。由于氮素是叶绿素的一个主要成分，所以叶绿素含量会受到氮肥水平的影响。近年来，为了提高产量，现代培育的品种需要施用较多的化学肥料，包括氮肥。过多的施用氮肥不仅降低了氮肥的利用效率，也增加了农业生产的成本，并导致了环境问题。因此，在较少的氮肥施用条件下提高叶绿素含量也许是提高氮肥利用效率的一个有效途径。
　　在本研究中，亲本93-11和PA64s杂交后获得了包含132个株系的重组自交系群体，并构建了一张高密度的遗传连锁图谱。利用该群体和图谱，检测了在两个时期两个供氮条件下控制顶三叶叶绿素含量的QTL。共检测到32个主效QTI分布在第1、4、5、6、7、3和12染色体上，单个QTL对表型的贡献率为6.0-20.8％。在这些QTL中，发现了一个在低氮条件下控制叶绿素含量的主效QTL，命名为qFCC7L，来自PA64s的等位基因能够增加叶绿素含量。这个QTL可能与水稻耐低氮胁迫的能力有关。93-11背景的染色体片段置换系包含了来自PA64s的qFCC7L区段，置换系与93-11相比具有更高的叶绿素含量和光合作用速率，同时也具有较小的比叶面积。利用一个BC4F2群体，最终将该QTL定位在7号染色体长臂上124.5kb的区间内。通过对候选基因进行分析发现基因OsPTR4在亲本间存在序列差异和表达量差异，可能导致功能上的不同。这些结果表明该QTL对培育较高光合作用能力的品种以及提高产量有着重要的意义，也为该QTL的克隆奠定了基础。
　　叶绿体是植物光合作用中最重要的光合器官，对维持植物的正常生命活动有着重要的意义。尽管有一些与叶绿体发育和叶绿素含量相关的基因已经被鉴定或克隆，但这些基因与植物非生物胁迫响应之间的关系仍然知之甚少。鉴定了一个新的水稻白条纹叶突变体wsl12，基因突变后影响了色素合成，叶绿体发育及对非生物胁迫的应答。该突变体在苗期和分蘖期的表型最为明显，并对温度敏感。遗传分析表明突变性状由一对单隐性核基因控制。图位克隆表明WSL12编码OsNDPK2，三个核苷二磷酸激酶之一。WSL12在所有检测的组织中均表达，且在叶片和幼嫩的组织中表达量较高。WSL12被定位在叶绿体中。wsl12突变体表现出较高的超氧阴离子浓度，并对ABA和盐胁迫更为敏感。且在wsl12突变体中，参与叶绿素合成、ABA合成、光信号通路、活性氧清除途径的基因表达量也有所改变，另两个核苷二磷酸激酶基因的表达量也有所变化。这些结果表明WSL12编码的核苷二磷酸激酶是一个多功能蛋白，通过调节相关基因的表达量在叶绿体发育和叶绿体发育途径中扮演着重要的角色。此外，由于WSL12也影响了水稻对非生物胁迫响应，对通过分子育种途径提高作物抗性有着重要的意义。

目录

声明

致谢

摘要

缩略语表

第一章 文献综述

1．1 引言

1．2 数量性状的研究方法

1．2．1 质量性状和数量性状

1．2．2 选择亲本

1．2．3 构建遗传群体

1．2．4 构建分子标记连锁图谱

1．2．5 QTL定位的方法

1．3 水稻叶片叶绿素含量QTL的研究进展

1．4 水稻叶色突变体的研究进展

1．4．1 水稻叶色突变体的分类和遗传机制

1．4．2 叶绿素的合成与降解

1．4．3 水稻叶色突变体基因的克隆进展

1．5 本研究的目的和意义

第二章 水稻叶绿素含量QTL qFCC7L的精细定位

2．1 材料与方法

2．2 常用试剂与仪器

2．2．1 化学试剂

2．2．2 主要实验仪器

2．3 实验方法

2．3．1 水稻DNA提取

2．3．2 聚合酶链式反应

2．3．3 DNA凝胶回收与纯化

2．3．4 水稻总RNA提取与cDNA反转录

2．3．5 组织表达特异性分析

2．3．6 性状测定

2．3．7 数据分析和QTL定位

2．3．8 定位群体构建

2．4 结果与分析

2．4．1 性状调查与结果分析

2．4．2 QTL定位及效应值分析

2．4．3 片段代换系性状分析

2．4．4 主效QTL qFCC7L的精细定位

2．4．5 候选基因OsPTR4分析

2．5 讨论

第三章 水稻白条纹叶突变体wsl12的克隆与功能分析

3．1 研究材料

3．2 常用试剂与仪器

3．2．1 药品试剂

3．2．2 主要实验仪器

3．2．3 主要菌株与载体

3．3 实验方法

3．3．1 突变体表型分析

3．3．2 武运粳7号和wsl12叶片组织透射电镜观察

3．3．3 NBT染色

3．3．4 WSL12的组织特异性表达分析

3．3．5 ABA含量的测定

3．3．5 载体构建

3．3．6 大肠杆菌的质粒提取

3．3．7 大肠杆菌和农杆菌转化

3．3．8 农杆菌介导的水稻愈伤遗传转化

3．3．9 水稻原生质体制备及转化

3．4 基因克隆和生理分析

3．4．1 wsl12的遗传分析和精细定位

3．4．2 候选基因分析及测序

3，4．3 温度敏感性分析

3．4．4 ABA敏感性分析

3．4．5 NaCL对种子发芽率的影响

3．5 结果与分析

3．5．1 突变体wsl12的表型分析

3．5．2 突变体wsl12和野生型叶片透射电镜分析

3．5．3 wsl12的突变性状受到温度的影响

3．5．4 WSL12的遗传分析和基因克隆

3．5．5 WSL12的表达模式分析

3．5．6 WSL12的亚细胞定位

3．5．7 WSL12的进化分析

3．5．8 WSL12的突变影响了叶绿素合成与叶绿体相关基因的表达

3．5．9 WSL12的突变提高了植株对ABA的敏感性

3．5．10 WSL12的突变提高了对NaCl的敏感性

3．5．11 WSL12的突变提高了植株的氧化水平

3．6 讨论

参考文献

附录

作者简历