大肠杆菌工程菌利用半纤维素水解液生产木糖醇的发酵工艺研究

摘要

木糖醇是一种戊糖醇，其甜度与蔗糖相当。由于具有防龋齿以及胰岛素不依赖性等优良特性，在食品，医药以及轻工业等领域具有广泛的用途。近年来，木糖醇的市场需求量不断增加。传统的木糖醇生产方法采用催化加氢法。在高温高压下，以金属镍为催化剂，生产成本较高，且会污染环境。利用生物法特别是代谢工程改造技术生产木糖醇已越来越引起人们的重视。本论文以本实验室构建的基因工程大肠杆菌，对发酵半纤维素水解液生产木糖醇的工艺条件进行了研究,获得了适合于工业化生产的工艺条件。
　　本文首先以代谢工程菌E.coli W3110（Ptrc99a-rbs-xr6600，△ptsG，△xylA，△xylB，△F）为生产菌株，以纯木糖为底物，研究发酵工艺条件。摇瓶中确定最佳种子培养条件为:种龄6h，pH为7.0，装液量为50mL/250mL，接种量10％，摇床转速为200r/min;最佳诱导条件为:接种4h后诱导，诱导浓度为0.1mM，诱导温度为30℃。木糖与葡萄糖最佳质量比为2∶1。在5L发酵罐中，确定了最佳溶氧值为30％，转速为500r/min，最佳通气量为0.6vvm，最佳底物浓度为100g/L木糖与50g/L葡萄糖。并在此基础上进行了流加发酵实验，木糖醇浓度达到了172g/L，生产效率达到了1.7g/L·h，质量得率为0.95g/g。
　　考虑到发酵纯木糖生产木糖醇，成本过高，不利于规模化生产。论文进一步以半纤维素水解液为底物，研究发酵生产木糖醇的方法。论文首先对培养基中的氮源成分进行了优化，成功用玉米浆干粉代替了蛋白胨酵母粉，降低了成本。进一步在5L发酵罐中对诱导条件进行了调整，方法为:接种6h后诱导，诱导浓度为0.05mM，诱导温度为30℃。由于水解液中含有很多抑制因子，随着浓度增高，抑制因子也会增加，不利菌体的生长。因此，论文对初始底物浓度进行了调整，确定60g/L木糖与30g/L葡萄糖为最佳底物浓度。在此基础上，进行了流加发酵实验，获得了最佳工艺条件。木糖醇的浓度达到了166g/L，生产效率达到了1.7g/L·h，质量得率达到了0.93g/g，为木糖醇的大规模生产奠定了基础。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 文献综述

1．1 木糖醇简介

1．2 木糖醇的性质与应用

1．2．1 木糖醇的食用性质与用途

1．2．2 木糖醇的药用性质与用途

1．2．3 木糖醇的其它用途与性质

1．3 木糖醇的生产与市场前景

1．4 木糖醇的生产

1．4．1 化学法生产木糖醇

1．4．2 生物法生产木糖醇

1．5 大肠杆菌生产木糖醇的改造策略

1．5．1 蛋白表达系统优化

1．5．2 混合糖的同时利用

1．5．3 增加木糖的利用率

1．5．4 切断木糖醇消耗途径

1．6 大肠杆菌生产木糖醇存在的问题

1．6．1 半纤维素水解痕的成分

1．6．2 培养基成分

1．6．3 发酵工艺

1．7 大肠杆菌发酵纯木糖生产木糖醇的发酵工艺

1．7．1 初始细胞浓度的影响

1．7．2 初始pH值的影响

1．7．3 温度的影响

1．7．4 溶氧值的影响

1．7．5 木糖浓度的影响

1．7．6 氮源种类与浓度的影响

1．7．7 无机盐的影响

1．8 大肠杆菌发酵半纤维素水解液生产木糖醇的发酵工艺

1．8．1 其他糖类的影响

1．8．2 木糖浓度的影响

1．8．3 水解液中抑制物的影响

1．8．4 发酵工艺的影响

1．8．5 氮源的影响

1．9 细菌发酵半纤维素水解液生产木糖醇的调控策略

1．10 本文选题背景及研究思路

1．10．1 选题背景

1．10．2 研究内容与思路

第二章 大肠杆菌W3110(Ptrc99a-rbs-xr6600，△ptsc，△xylA，△xylB，△F)发酵工艺的单因素优化

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 菌株，质粒与引物

2．2．2 培养基

2．2．3 主要试剂

2．2．4 主要仪器

2．3 实验方法

2．3．1 发酵菌株的构建

2．3．2 菌株培养方法

2．3．3 发酵条件优化

2．3．4 葡萄糖与木糖质量比的优化

2．3．5 诱导条件优化

2．3．6 分析方法

2．4 结果与讨论

2．4．1 葡萄糖，木糖与木糖醇标准曲线

2．4．2 发酵培养条件的单因素优化

2．4．3 葡萄糖与木糖质量比的优化

2．4．4 发酵诱导务件的优化

2．5 小结

第三章 以纯木糖为底物的工程菌发酵工艺放大研究

3．1 引言

3．2 实验材料

3．2．1菌株

3．2．2 培养基

3．2．3 主要试剂

3．2．4 主要仪器

3．3 实验方法

3．3．1 菌种培养方法

3．3．2 5L罐的分批发酵实验

3．3．3 5L罐初始底物浓度优化实验

3．3．4 15L罐的流加发酵实验优化实验

3．3．5 15L罐流加发酵实验

3．3．6 分析方法

3．4 结果与讨论

3．4．1 溶氧值的优化

3．4．2 搅拌转速的优化

3．4．3 通气量的优化

3．4．4 初始木糖浓度的优化

3．4．5 15L罐流加策略优化

3．4．6 15L发酵罐流加发群实验

3．5 小结

第四章 以半纤维素水解液为底物的大肠杆菌发酵条件优化

4．1 引言

4．2 实验材料

4．2．1 菌株

4．2．2 培养基

4．2．3 主要试剂

4．2．4 主要仪器

4．3 实验方法

4．3．1 菌种培养方法

4．3．2 培养基优化

4．3．3 5L发酵罐底物浓度优化

4．3．4 5L发酵罐诱导条件优化

4．3．5 15L发酵罐流加策略优化

4．3．6 15L发酵罐流加发酵实验

4．3．7 分析方法

4．4 结果与讨论

4．4．1 葡萄糖，木糖，木糖醇，阿拉伯糖与阿拉伯糖醇标准曲线

4．4．2 半纤维素水解液成分分析

4．4．3 发酵培养基组成的优化

4．4．4 5L发酵罐底物浓度优化

4．4．5 5L发酵罐诱导条件优化

4．4．6 15L发酵罐流加策略的比较

4．4．7 15L发酵罐流加发酵实验

4．5 小结

第五章 结论与展望

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

作者简介

教育简介

攻读硕士学位论文期间主要科研成果