宏基因组测序研究介体烟粉虱中的双生病毒多样性

摘要

粉虱传双生病毒(whitefly transmitted geminiviruses，WTGs)属于双生病毒科菜豆金色花叶病毒属，由烟粉虱传播，危害多种重要经济作物。了解WTGs种类及生物学特性对病毒的防治具有积极的意义。本研究从传毒介体烟粉虱入手，结合宏基因组测序和分子生物学手段研究粉虱传双生病毒的种类和变异进化，以期了解我国粉虱传双生病毒的种群多样性，为粉虱传双生病毒的防治奠定基础。
　　2011-2015年，我们从云南、广西、广东、海南、浙江和山东的多个地区共采集23批烟粉虱样品。从烟粉虱中提取病毒DNA并分为9个建库样品，利用Illumina Miseq测序平台进行病毒宏基因组测序。经contigs拼接和比对，9个建库样品都检测到多种粉虱传双生病毒。我们对检测结果进行PCR验证，共检测到18种病毒，8种betasatellites，2种alphasatellites，10种来源于病毒DNAA的缺陷型小分子和1种来源于betasatellite的缺陷型小分子。18种病毒中，一个为双生病毒新种，暂名为粉虱传双生病毒A(Whitefly Transmitted Geminiviruse A，WTGA)，并在中国首次发现越南丁香黄脉病毒(Ludwigiayellow vein Vietnamvirus，LuYVVNV)。云南省检测到11种病毒，分别为云南赛葵黄脉病毒(Malvastrumyellow vein Yunnan virus，MYVYnV)、中国番木瓜曲叶病毒(Papayaleaf curl China virus，PaLCuCNV)、甘薯曲叶病毒(Sweet potato leaf curl virus，SPLCV)、LuYVVNV、丁香黄脉病毒(Ludwigiayellow vein virus，LuYVV)、云南烟草曲叶病毒(Tobacco leaf curl Yunnan virus，TbLCYnV)、中国番茄黄化曲叶病毒(Tomatoyellow leaf curl China virus，TYLCCNV)、中国胜红蓟黄脉病毒(Ageratumyellow vein China virus，AYVCNV)、番茄黄化曲叶病毒(Tomatoyellow leaf curlvirus，TYLCV)、中国辣椒黄化曲叶病毒(Pepperyellow leaf curl China virus，PepYLCCNV)及病毒新种WTGA;广西检测到9种病毒，分别为PaLCuCNV、AYVCNV、WTGA、MYVYnV、SPLCV、中国南瓜曲叶病毒(Squash leaf curl Chinavirus，SLCCNV)、中国番茄曲叶病毒(Tomato leaf curl China virus，ToLCCNV)、广西番茄曲叶病毒(Tomato leaf curl Guangxi virus，ToLCGxV)和雾水葛金色花叶病毒(Pouzolzia golden mosaic virus，PGMV);海南省检测到4种病毒，依次为SPLCV、SLCCNV、LuYVVNV和黄花稔曲叶病毒(Sida leaf curl virus，SiLCV);浙江省检测4种双生病毒，分别为TYLCV、SPLCV、乔治亚甘薯曲叶病毒(Sweetpotato leaf curl Georgia virus，SPLCGV)和河南甘薯曲叶病毒(Sweet potato leaf curlHenan4 virus，SPLCHn4V);山东省检测到TYLCV。广东省的样品未检测到病毒。对其中13种病毒进行变异进化分析，结果发现，与植物中分离的同种双生病毒相比，来源于烟粉虱样品中的病毒分离物的同源性相对较高;其病毒序列的变异程度相对较低，并且两者的变异位点存在明显差异;系统关系树分析发现，分离自烟粉虱和植物的病毒都依据地域不同而形成不同的分支。
　　从云南和广西的烟粉虱样品中分离到一个双生病毒新种，全长为2744 bp，与印度分离的巴豆黄脉花叶病毒(Crotonyellow vein mosaic virus，CYVMV)同源性最高(87％)，根据双生病毒分类命名原则，将其暂名为WTGA。WTGA是一个不含有卫星的单组份双生病毒，推测其可能是由CYVMV、云南南瓜曲叶病毒(Squash leaf curl Yunnan virus，SLCYnV)、假马鞭曲叶病毒(Synedrella leaf curlvirus，SyLCV)、烟草曲茎病毒(Tobacco curly shoot virus，TbCSV)和泰国烟草曲叶病毒(Tobacco leaf curl Thailand virus，TbLCTHV)重组形成的。构建了WTGA的侵染性克隆，致病性测定发现，WTGA单独接种及与卫星TYLCCNB或AYVCNB共同接种本氏烟都能产生叶片上卷、皱缩、脉突、褪绿以及植株矮化等病毒症状，但与卫星共同接种，本氏烟提早3-4天显症，且症状较重。Southern印迹显示，WTGA单独或与卫星共同接种的植株中都能明显检测到WTGA的积累。
　　从云南和海南的样品中分离到LuYVVNV，全长2762 bp，与越南分离物的同源性达到94.2％，这是LuYVVNV在我国的首次报道。LuYVVNV是一个不含有卫星的单组份病毒，具有典型的菜豆金色花叶病毒属病毒的基因组结构。构建了LuYVVNV的侵染性克隆，致病性测定发现，LuYVVNV单独接种及与卫星TYLCCNB或AYVCNB共同接种本氏烟，都能产生叶片下卷，皱缩、黄化以及植株矮化等症状，但与卫星共同接种时，本氏烟的病毒症状更为严重。Southern印迹显示，LuYVVNV单独或与卫星共同接种的植株中都能明显检测到LuYVVNV的积累。

目录

声明

致谢

摘要

1 研究背景

1．1 粉虱传双生病毒

1．1．1 粉虱传双生病毒及其危害

1．1．2 烟粉虱及其危害

1．2 双生病毒检测方法

1．2．1 生物学检测

1．2．2 分子生物学检测

1．2．3 电子显微镜技术

1．2．4 血清学检测

1．2．5 高通量测序

1．3 研究的目的和意义

2 实验材料与实验方法

2．1 烟粉虱采集

2．1．1 烟粉虱采集点的确定

2．1．2 样品采集的方法

2．1．3 样品采集信患

2．2 烟粉虱样品前处理

2．2．1 试剂盒法提取病毒DNA前处理

2．2．2 快速提取烟粉虱总DNA法

2．3 QIAamp MinElute Virus Spin kit(QIAGEN)提纯病毒

2．4 病毒DNA的富集

2．5 PCR扩增

2．6 PCR产物纯化

2．7 连接

2．8 感受态细胞的制备

2．9 转化

2．10 菌落PCR筛选

2．11 阳性克隆的测序鉴定及序列分析

3 宏基因组测序检测烟粉虱中双生病毒

3．1 材料与方法

3．1．1 测序样品信息

3．1．2 双生病毒DNA提取与謇集

3．1．3 病毒DNA质量检测

3．1．4 样品的混合及寄送

3．1．5 病毒DNA宏基因组测序及组装

3．1．6 病毒组成的分析

3．2 结果与分析

3．2．1 病毒DNA的质量检测

3．2．2 Miseq测序数据产出及质量控制

3．2．3 SPAdes组装结果

3．2．4 病毒种类注释结果

3．3 讨论

4 PCR验证宏基因组测序结果及分析

4．1 材料与方法

4．1．1 实验材料

4．1．2 烟粉虱中双生病毒DNA提纯及富集

4．1．3 引物设计

4．1．4 病毒金长序列的测定

4．1．5 病毒序列分析

4．1．6 病毒分子的同源性分析

4．1．7 病毒分子的变异进化研究

4．2 结果与分析

4．2．1 宏基因组测序结果PCR验证

4．2．2 烟粉虱携带的双生病毒交异进化分析

4．3 讨论

5 粉虱传双生病毒A和越南丁香黄脉病毒的分子鉴定及致病性测定

5．1 材料与方法

5．1．1 病毒来源

5．1．2 病毒DNA提取

5．1．3 PCR扩增、克隆以及全基因组DNAA序列测定和分析

5．1．4 DNA B组分、betasatellite和alphasatellite分子的检测

5．1．5 序列分析

5．1．6 粉虱传双生病毒A侵染性克隆构建

5．1．7 越南丁香黄脉病毒的侵染性克隆构建

5．1．8 重组质粒的提取

5．1．9 重组质粒的酶切鉴定

5．1．10 重组质粒电击转化EHA105

5．1．11 农杆菌接种

5．1．12 病毒DNA的检测

5．1．13 Southern印迹分析

5．2 结果与分析

5．2．1 双生病毒新种—粉虱传双生病毒A的分子鉴定及致病性测定

5．2．2 我国首次发现的双生病毒—越南丁香黄脉病毒的分子鉴定及致病性测定

5．3 讨论

6 全文小结

参考文献

附录