光酶诱导桑叶中桑辛素N抗BmNPV机制及其生物合成关键酶的研究

摘要

家蚕（Bombyx moriL.）属鳞翅目、蚕蛾科，家蚕核型多角体病毒（BmNPV）病是家蚕饲养过程中最常见、最严重的一类蚕病，造成了蚕桑业巨大的经济损失。目前，针对家蚕BmNPV病仍然没有有效的治疗方法，其抗病机制尚不清楚。桑叶是家蚕的主要食物来源，也是一种重要的药用植物。前期研究发现，桑叶经UV-B诱导之后，次生代谢产物的含量发生变化，其中桑辛素N的含量显著增加。本文首次发现饲喂UV-B诱导的桑叶能提高家蚕对于BmNPV病的抗性，并推测桑辛素N是其主要的有效成分。利用label-free技术对家蚕中肠蛋白进行差异蛋白质组学分析，揭示了诱导桑叶及桑辛素N的抗病机制。研究结果为家蚕核型多角体病的治疗提供了新的方案，也为之后的研究奠定了基础。此外，对诱导桑叶中桑辛素N的生物合成关键酶进行了研究，发现诱导桑叶中存在一种新型氧化环合酶，能催化氧化白藜芦醇环合生成桑辛素N的重要前体——桑辛素M。该研究结果为探讨UV-B诱导桑叶中次生代谢产物的变化奠定了基础。本文的主要研究内容和结果如下:
　　(1)光酶诱导桑叶中桑辛素N抗BmNPV的机制研究
　　BmNPV是对家蚕造成危害最大的病毒之一，家蚕在患BmNPV病后期常流出脓汁，内含大量的多角体病毒，俗称脓病。这类疾病造成家蚕死亡，导致了蚕桑业的巨大经济损失。家蚕抗病毒实验发现饲养UV-B诱导的桑叶或涂有桑辛素N的桑叶之后，家蚕对BmNPV病的抗性得到提高，感染病毒之后死亡率降低。为了进一步研究其抗病机制，分别取饲喂诱导桑叶（BUM）与桑辛素N（BNM）的家蚕中肠进行比较蛋白质组学分析，结果在BUM组与BNM组中分别鉴定到413和102个差异蛋白。利用生物信息学进一步分析，发现诱导桑叶和桑辛素N可使较多的核糖体蛋白表达变化，调控蛋白的合成、DNA的修复;可以使ATP酶表达上调、ATP合成酶表达下调，以此改变细胞内环境来阻止病毒脱壳进去细胞核，抵抗病毒的侵染。此外，桑辛素N还可以使细胞色素氧化酶、Ca2+相关蛋白与programmed cell death protein表达上调从而促进细胞凋亡，抑制病毒扩散与复制;可以使lipase-1与serine protease precursor表达上调，来增强家蚕机体免疫力，抵抗病毒入侵;可以使组蛋白、Rab蛋白表达上调，前者可与病毒结合，后者可作为信号分子，在家蚕抗BmNPV过程中起到特殊作用。以上结果揭示了诱导桑叶和桑辛素N的抗病过程，这对于提高感染BmNPV家蚕的存活率是一个新的治疗方案。
　　(2)诱导桑叶中桑辛素N生物合成关键酶的研究
　　桑（Morus albaL.），桑科桑属，落叶乔木或灌木，是一种重要的药用植物，具有多种药理作用，也是家蚕的主要食物来源。桑辛素是桑叶中重要的次生代谢产物，具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒等活性。桑叶经UV-B诱导，次生代谢产物的含量发生变化，其中桑辛素N的含量显著增加。目前，关于桑辛素N的化学合成已经有报道，但是其生物合成至今无详细的报道。课题组前期研究工作发现桑辛素N生物合成的重要前体是桑辛素M，本文首次发现了诱导桑叶中存在一种新型桑辛素氧化环合酶能催化氧化白藜芦醇环合生成桑辛素M，这对于阐明桑辛素N的生物合成具有重要意义。此外，通过酶活反应，发现UV-B诱导或暗培养的桑叶中桑辛素氧化环合酶活性增高。利用单因素实验、正交实验对桑辛素氧化环合酶的提取条件进行优化，结果显示提取液pH为7.5，料液比(g/mL)为1∶10，提取液浓度为100 mM并添加10mM的Na2-EDTA时，浸提时间为2h，反应温度为30℃时，酶比活力最高。上述研究结果为之后桑叶氧化环合酶的分离与纯化奠定了基础。

目录

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致谢

摘要

缩写表

第一章 绪论

1．1 家蚕核型多角体病毒的研究进展

1．1．1 病毒形态与生物学特征

1．1．2 病毒的致病作用与机理

1．2 家蚕抗核型多角体病毒的研究进展

1．2．1 基因水平上抗核型多角体病毒研究进展

1．2．2 蛋白水平上抗核型多角体病毒研究进展

1．2．3 家蚕抗核型多角体病毒的可能途径与机制

1．3 桑辛素N的研究进展

1．3．1 桑辛素N的药理作用

1．3．2 桑辛素N的生物合成研究进展

1．4 本文的研究内容与意义

第二章 光酶诱导桑叶中桑辛素N抗BmNPV的机制研究

2．1 引言

2．2 实验材料与方法

2．2．1 实验材料与试剂

2．2．2 实验仪器

2．2．3 家蚕饲养与组织分离

2．2．4 蛋白提取与定量

2．2．5 蛋白纯化、酶解与质谱鉴定

2．2．6 蛋白鉴定与分析

2．2．7 实时荧光定量qRT-PCR分析

2．2．8 数据处理与统计分析

2．3 实验结果

2．3．1 不同组家蚕对于BmNPV毒力的检测

2．3．2 蛋白鉴定、定量分析与差异比较

2．3．3 差异表达蛋白的GO分类

2．3．4 差异表达蛋白的KEGG分析

2．3．5 家蚕抗病过程中关键差异蛋白的基因表达量分析

2．4 讨论

2．4．1 诱导桑叶或桑辛素N可以降低感染病毒后家蚕的死亡率

2．4．2 核糖体蛋白表达改变对家蚕抗病毒能力的影响

2．4．3 诱导桑叶和桑辛素N通过改变细胞内环境影响家蚕抗病毒能力

2．4．4 细胞凋亡在家蚕抗病毒过程中起到重要作用

2．4．5 提高机体免疫力对家蚕抗病能力的影响

2．4．6 特殊蛋白对提高家蚕抗病能力的影响

2．5 本章小结

第三章 桑叶中桑辛素N生物合成关键酶的研究

3．1 引言

3．2 实验材料与方法

3．2．1 植物材料与实验试剂

3．2．2 实验仪器

3．2．3 蛋白浓度的测定方法

3．2．4 化合物桑辛素M的标曲制定

3．2．5 酶促反应及酶活检测方法

3．3 实验结果

3．3．1 桑辛素N生物合成关键酶的底物探讨

3．3．2 桑辛素N生物合成中氧化环合酶提取方式的优化与探讨

3．4 讨论

3．4．1 桑辛素N的生物合成探讨及氧化环合酶的发现

3．4．2 紫外诱导或暗培养对桑叶氧化环合酶的影响

3．4．3 桑辛素N生物合成中氧化环合酶的提取条件优化

3．5 本章小结

4．1 总结

4．2 展望

参考文献

附表

作者简介