聚马来酸烷基酯-侧链烷基氨阳离子聚合物载体库的平行合成及在肿瘤基因治疗中的应用

摘要

基因治疗是指将外源治疗基因输送到靶细胞、以纠正或补偿基因缺陷的一种遗传水平上的治疗方法。在过去的几十年中，基因治疗已被证实是一种有效的具有低副作用的癌症治疗新手段。非病毒基因输送载体包括阳离子聚合物、月旨质体、树枝状大分子和多肽等，因其具有生物相容性良好、免疫原性低、易于化学修饰和制备方便等特点而成为各大科研机构的研究热点。然而与病毒载体相比，其临床应用受限于低效的基因转染效率。阳离子聚合物通过静电相互作用中和负电性的DNA将其压缩成纳米颗粒，保护DNA免受降解，同时促进细胞摄取，将DNA输送到靶细胞中进行转染。
　　迄今为止，已有大量的工作致力于通过平行合成的方式筛选出具有高转染效率的阳离子聚合物。平行合成作为一种能够通过调整单体结构快速合成大量具有功能多样性聚合物的手段已经引起越来越多的关注。在高通量筛选后，可挑选出具有高转染效率的聚合物，并且可以清晰地阐明聚合物结构和转染效率之间的关系，这对于今后设计高效转染效率的非病毒基因输送载体具有重要意义。目前用于平行合成的方法往往局限于胺与丙烯酸酯或环氧反应，氨基硫醇与吖内酯加成后的开环聚合反应或passerini反应。因此我们迫切需要设计新型的载体合成路线来制备用于基因输送的一系列高转染效率的阳离子聚合物。
　　在此，本论文报道一种后修饰的方法来简易合成一系列酯酶响应性的阳离子聚合物基因输送载体。我们通过巯烯点击反应将18种巯基胺侧链单体键合于7种聚马来酸烷基酯主链上，构建出一个包含126种可降解阳离子聚合物的基因输送载体库，从而克服现存载体库在功能和可扩展性方面的限制，并证明不同结构特征对基因输送的影响。首先，使用荧光素酶编码质粒作为报告基因，借助半高通量筛选的方法，评价阳离子聚合物的基因表达水平。在126种载体中，共有7种表现出高效的转染效率，同时具有良好的抗血清能力。其次，使用增强的绿色荧光蛋白编码质粒作为报告基因检测表达细胞的百分比来评估7种聚合物的转染效率。我们总结出聚合物结构对DNA包裹能力，转染效率，polyplex大小的影响。再次，构建HeLa腹腔瘤模型，评价转染效果最佳的载体G-1的抑瘤效果。G-1/pTRAIL纳米复合物能够成功将治疗基因TRAIL输送到肿瘤部位，表现出明显高于PEI25k/pTRAIL的抑瘤效率，同时没有毒副作用。

目录

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致谢

摘要

缩略语表

第一章 绪论

1．1 基因治疗

1．2 基因输送技术

1．2．1 物理转染技术

1．2．2 病毒载体输送系统

1．2．3 非病毒载体输送系统

1．3 非病毒载体基因输送的屏障

1．3．1 细胞内吞

1．3．2 内含／溶酶体逃逸

1．3．3 细胞核摄取

1．3．4 Polyplex解离

1．3．5 EPR效应

1．4 刺激响应型基因输送系统

1．4．1 酯酶响应

1．4．2 ATP响应

1．4．3 还原响应

1．4．4 氧化响应

1．4．5 pH响应

1．4．6 光响应的纳米载药体系

1．5 阳离子聚合物基因输送载体的平行合成

1．6 课题的提出

第二章 聚马来酸烷基酯-侧链烷基氨阳离子聚合物基因输送载体库的合成及表征

2．1 引言

2．2 实验材料和仪器

2．2．1 实验药品及试剂

2．2．2 实验仪器

2．3 实验方法

2．3．1 聚马来酸烷基酯的合成

2．3．3 2，2-双苄氨基乙硫醇的合成(巯基胺5)

2．3．4 合成途径1：胱胺二盐酸盐与丙烯酸酯的反应(巯基胺6，7，8)

2．3．5 合成途径2：环硫乙烷与二级胺的反应(巯基胺9-15)

2．3．6 2-巯基-N，N，N-三甲基乙铵的合成(巯基胺16)

2．3．8 聚马来酸烷基酯-侧链烷基氨阳离子聚合物基因输送载体的合成

2．4 结果与讨论

2．4．1 聚马来酸烷基酯的制备与表征

2．4．2 2-苄氨基乙硫醇的合成(巯基胺4)

2．4．3 2，2-双苄氨基乙硫醇的合成(巯基胺5)

2．4．4 合成途径1：胱胺二盐酸盐与丙烯酸酯的反应(巯基胺6，7，8)

2．4．5 合成途径2：环硫乙烷与二级胺的反应(巯基胺9-15)

2．4．6 2-巯基-N，N，N-三甲基乙铵的合成(巯基胺16)

2．4．7 1-(2-巯基乙基)胍的合成(巯基胺17)

2．4．8 聚马来酸烷基酯-侧链烷基氨阳离子聚合物基因输送载体的合成

2．5 本章小结

第三章 聚马来酸烷基酯-侧链烷基氨阳离子聚合物基因转染性能的研究

3．1 引言

3．2 实验材料和仪器

3．2．1 实验药品及试剂

3．2．2 实验仪器

3．2．3 细胞系及实验动物

3．2．4 工作溶液

3．3 实验方法

3．3．1 质粒的扩增与提取

3．3．3 纳米复合物的粒径分布和Zeta电位测定

3．3．4 纳米复合物的体外细胞转染

3．3．5 细胞毒性实验

3．3．6 透射电镜观察纳米复合物的形态

3．3．7 纳米复合物的凝胶阻滞电泳实验

3．3．8 细胞内吞抑制剂对纳米复合物细胞摄取和转染的影响

3．3．9 激光共聚焦显微镜观察纳米复合物的亚细胞分布

3．3．10 G-1／pTRAIL纳米复合物腹腔瘤体内抑瘤实验

3．3．11 肿瘤组织病理切片

3．4 结果与讨论

3．4．1 纳米复合物的粒径分布和Zeta电位

3．4．2 纳米复合物的体外细胞转染

3．4．3 细胞毒性实验

3．4．4 不同DNA浓度下7种高转染纳米复合物的荧光素酶表达

3．4．5 G-1／DNA纳米复合物在4T1肿瘤细胞系的转染和细胞毒性实验

3．4．6 动态光散射仪(DLS)、透射电镜(TEM)表征G-1／DNA纳米复合物

3．4．7 G-1／DNA纳米复合物的凝胶阻滞电泳实验

3．4．8 细胞内吞抑制剂对纳米复合物细胞摄取和转染的影响

3．4．9 纳米复合物的亚细胞分布

3．4．10 G-1／pTRAIL纳米复合物的腹腔瘤体内抑瘤实验

3．5 本章小结

第四章 结论与展望

参考文献

作者简历及在校期间所取得的科研成果