巨球百合离体再生和遗传转化研究

摘要

本文以巨球百合(Lilium brownii F.E.Brown ex Miellez var.giganteum G.Y.Li&Z.H.Chen)为主要研究对象，以其原种野百合(L.brownii F.E.Brown.ex Miellez)，主栽商品种东方百合‘索邦’(L.Oriental Hybrids' Sorbonne’)为对比材料，对三种百合在离体条件下的离体再生能力进行了比较，明确了基因型差异，并进行了组织细胞学观察，旨在深入挖掘巨球百合这一特异性材料的潜在优势，为鳞茎发育研究提供思路。此外，建立并优化了巨球百合的遗传转化体系，为实现分子育种奠定了基础。主要研究结果如下:
　　1.巨球百合离体条件下的优势探索
　　(1)直接器官发生和小鳞茎增殖研究
　　明确了三种百合小鳞块的最佳诱芽培养基。巨球百合诱芽速度快，出芽强壮，平均诱导率为100％，平均诱芽数目最多（2.96个），且芽长显著高于‘索邦’及野百合。组织细胞学观察发现，巨球百合初期细胞小，数目多，每个细胞中的淀粉粒含量多，暗示较强的分生能力。诱芽10d后母鳞片中细胞分裂旺盛，细胞大小逐渐赶超‘索邦’和野百合。初步证实了巨球百合在离体条件下表现良好，直接器官发生能力最强。
　　明确了三种百合小鳞茎增殖的最佳培养基。增殖过程中巨球百合的鳞茎高增大倍数、鳞茎直径增大倍数和鳞片增殖系数始终较高，小鳞茎膨大速度快，鳞片增数多。在增殖前期(35 d)，巨球百合的鳞茎增殖系数最低，以鳞茎膨大为主，在增殖35d至90d时，鳞茎高和直径增大倍数保持最高，并形成丛生小鳞茎，增殖系数反超野百合，略低于优势杂交种‘索邦’。
　　(2)间接器官发生和愈伤组织状态研究
　　明确了三种百合鳞片薄层切片和叶片的最佳诱导愈伤组织培养基，巨球百合通过两种外植体诱导出的愈伤组织状态均最好。野百合以鳞片薄层切片、叶片为外植体时愈伤组织诱导率均最高。‘索邦’的脱分化能力较弱，只有在添加毒莠定(PIC)的培养基中才能诱导出愈伤组织，否则直接出芽。巨球百合鳞片诱导出的胚性愈伤组织在五种增殖培养基上的直径增长率均最大，并且在继代过程中，胚性保持最好，野百合居中，‘索邦’最差。
　　对三种百合愈伤组织进行组织细胞学观察未发现显著差异，每0.5 mm3的愈伤组织团块均同时包括分裂旺盛的胚性细胞及空洞的非胚性细胞。两年生愈伤组织中淀粉粒积累较多，新旧愈伤组织中都存在着旺盛的细胞分裂，均为胚性愈伤组织。‘索邦’以鳞片和叶片为不同外植体诱导出的愈伤组织虽状态不及巨球百合和野百合，但组织细胞学观察到细胞分裂旺盛，为胚性愈伤组织。
　　2.巨球百合遗传转化体系的建立和优化
　　(1)胚性愈伤组织高效再生体系
　　愈伤组织再生前在黑暗条件下过渡7d可将再生率提高1倍，达到100％，再生芽数提高到16倍，每粒0.5 mm3的愈伤组织团块平均可诱出14.33个芽，且芽生长状态好。最佳再生培养基为不添加激素的MS培养基，在此培养基上再生90 d后再转入含有高浓度蔗糖(60 g/L)的培养基上培养60 d后，平均每粒0.5 mm3的愈伤组织可获得16.87个小鳞茎。
　　(2)抗生素筛选浓度确定
　　未能确定巨球百合胚性愈伤组织卡纳霉素（Kanamycin，Kan）筛选浓度，因其对浓度范围为0～150 mg/L的Kan响应无规律性。本试验中，认为Kan不适于用作以胚性愈伤组织为转化受体时的筛选抗生素。但以鳞片薄层切片为转化受体时，Kan筛选浓度为75 mg/L。
　　在愈伤组织团体积为0.5 mm3，潮霉素(Hygromycin，Hyg)浓度为60 mg/L时，愈伤组织完全褐化死亡;当愈伤组织团体积为0.2 mm3，Hyg浓度为50 mg/L时，愈伤组织完全褐化死亡。愈伤组织体积对结果有一定影响，适用于筛选抗性愈伤组织的Hyg浓度为50～60 mg/L。适用于筛选鳞片薄层切片的Hyg浓度为40 mg/L。鳞片薄层切片相对于愈伤组织对抗生素更为敏感。
　　(3)巨球百合遗传转化体系优化
　　以胚性愈伤组织和鳞片薄层切片为受体转化了水稻REM1.3基因，并优化了转化体系。试验结果表明，相比鳞片薄层切片，胚性愈伤组织抗性组织获得率显著高，更适宜作为转化受体。20 min为胚性愈伤组织和鳞片薄层切片的最适侵染时间。适宜侵染胚性愈伤组织的菌液浓度为OD600=0.4，适宜侵染鳞片薄层切片的菌液浓度为OD600=0.8。共培养方式（固、液培养基）对转化效率的影响不大。侵染液和共培养培养基成分对转化率影响显著，当侵染液和共培养培养基中去除全部大量元素，微量元素，铁盐和有机物时，胚性愈伤组织和鳞片薄层切片的抗性组织获得率最高，分别达到30.67％和15.00％。获得的抗性愈伤组织再生苗有白化现象。

目录

声明

致谢

摘要

图目录

表目录

缩略语表

1 文献综述、研究内容及技术路线

1．1 百合概述

1．2 百合分类

1．2．1 野生种分类

1．2．2 园艺栽培种的分类

1．2．3 浙江省野生百合资源

1．3 百合直接器官发生研究进展

1．3．1 直接器官发生的影响因素

1．3．2 直接器官发生过程中的形态和组织细胞学观察

1．4 百合鳞茎发育和离体小鳞茎膨大研究进展

1．4．1 鳞茎发育过程

1．4．2 小鳞茎膨大的影响因素

1．5 百合间接器官发生途径研究进展

1．5．1 百合愈伤组织诱导

1．5．2 百合愈伤组织增殖

1．5．3 百合愈伤组织再生

1．6 百合遗传转化研究进展

1．6．1 百合遗传转化的育种目标

1．6．2 百合遗传转化体系的基本内容

1．7 本研究的研究目的和意义

1．8 主要研究内容

1．9 技术路线

2 三种百合离体条件下直接器官发生能力和小鳞茎增殖比较

2．1 材料与方法

2．1．1 试验材料

2．1．2 试验方法

2．1．3 观察与统计

2．1．4 数据处理

2．2 结果与分析

2．2．1 三种百合鳞片诱芽

2．2．2 小鳞茎增殖

2．3 讨论

2．3．1 直接器官发生中的基因型差异和直接再生体系建立

2．3．2．鳞片组织细胞学观察

2．3．3 小鳞茎形成

3 三种百合离体条件下间接器官发生能力比较

3．1 材料与方法

3．1．1 试验材料

3．1．2 试验方法

3．1．3 观察与统计

3．1．4 数据处理

3．2 结果与分析

3．2．1 三种百合鳞片诱愈

3．2．2 三种百合叶片诱愈

3．2．3 愈伤组织增殖

3．2．4 愈伤组织细胞学观察

3．3 讨论

3．3．1 体胚发生能力的基因型差异

3．3．2 愈伤组织细胞学观察

4 巨球百合遗传转化体系的建立和优化

4．1 材料与方法

4．1．1 试验材料

4．1．2 试验方法

4．1．3 数据处理

4．2 结果与分析

4．2．1 巨球百合胚性愈伤组织最佳再生条件的确定

4．2．2 抗生素筛选浓度的确定

4．2．3 巨球百合遗传转化体系的优化

4．2．4 筛选和抗性苗获得

4．3 讨论

4．3．1 巨球百合愈伤组织高效再生体系建立

4．3．2 筛选用抗生素的选择

4．3．3 培养条件对转化的影响

4．3．4 转化适用的受体系统

5 结论与展望

5．1 主要结论

5．1．1 三种百合直接器官发生能力

5．1．2 三种百合小鳞茎增殖研究

5．1．3 三种百合间接器官发生能力研究

5．1．4 巨球百合遗传转化体系的建立和优化

5．2 主要创新点

5．3 不足与展望

参考文献

作者简历及在学期间所取得的研究成果