戊唑醇对斑马鱼成鱼HPG轴的内分泌干扰效应

摘要

近年来，三唑类杀菌剂因活性高而得到广泛应用。当前，三唑类杀菌剂是市场份额最大的品类之一，其中戊唑醇使用量多年来稳居三唑类首位，在所有杀菌剂品种中位列第二。然而，由于其被大量的使用所带来的对环境和健康的潜在危害问题未得到足够的重视，有关戊唑醇的环境毒理学研究报道很少。本文以斑马鱼为模式生物，采用UHPLC-MS/MS(Ultra High-Performance LiquidChromatography-Tandem Mass Spectrometry)方法研究了戊唑醇在斑马鱼体内的富集性、持留性及其在不同组织器官中的分布情况。在此基础上，研究了戊唑醇短期曝露后以及经净化清除后，斑马鱼体内抗氧化酶系活性、性激素含量、类固醇合成代谢相关基因表达量等的变化情况，对性腺进行了病理学切片观察，进一步观察了亲代曝露后对子代的毒性传递效应，以期较为全面的揭示其对斑马鱼成鱼的生殖内分泌干扰效应，初步探讨其可能的作用机制。主要研究结果如下。
　　1.对斑马鱼成鱼进行了戊唑醇(0.18 mg/L)连续28 d曝露，再连续30 d净化清除，以期了解戊唑醇在斑马鱼体内的富集性、持留性及其分布情况。结果表明:(1)曝露28 d后，戊唑醇在斑马鱼体内的浓度达到平衡，为3.69 mg/kg，生物富集系数BCF值为21.7，属于中等富集性农药，且富集动力学符合准一级动力学方程;在曝露期间，斑马鱼体重、体长和对照组相比显著下降，肝脏指数(LSI)和性腺指数(GSI)下降。(2)戊唑醇可在斑马鱼体内较长持留，缓慢代谢。经30 d净化清除试验后，鱼体内戊唑醇的浓度为0.49 mg/kg，为初始曝露浓度的2.7倍。与对照相比，试验组雌性斑马鱼的体重下降(p＜0.01）;斑马鱼的LSI、GSI和对照相比均仍有不同程度的下降，但差异不显著，且和前期曝露组相比，略有上升。(3)富集平衡后，戊唑醇在斑马鱼不同组织和器官中的分布顺序为:肝脏(5.71 mg/kg)＞性腺(3.46 mg/kg)＞全鱼(3.03 mg/kg)＞躯干(2.50 mg/kg)＞鱼脑(0.37 mg/kg)。肝脏组织中戊唑醇的质量浓度最高，为曝露浓度的31倍，性腺次之，为19倍，说明肝脏和性腺对戊唑醇具有较强富集作用。
　　2.研究测定了戊唑醇不同浓度曝露及再净化清除后，斑马鱼体内的氧化酶系的活力变化。研究发现:(1)在戊唑醇0.18、0.92和1.84 mg/L三个浓度水平连续28 d曝露后，雌、雄斑马鱼肝脏中SOD、CAT、POD和GST酶活力均上调，为对照组的1.11-3.43倍(p＜0.05)，且呈现剂量-效应关系。结果表明戊唑醇对斑马鱼的体内抗氧化酶活性具有明显的激活诱导作用。(2)曝露后经30d净化清除，雌、雄斑马鱼肝脏中SOD酶活力依旧上调，为对照的1.26-1.87倍(p＜0.05);CAT酶活力分别为除低浓度组仍上调外，其余浓度组与对照组相比无显著性差异;POD酶活力在高浓度组保持上调;GST酶活力雌鱼在中高浓度组保持上调，而雄鱼体内已经恢复至对照水平。结果表明，随着戊唑醇在体内的逐步清除，斑马鱼的体内抗氧化酶活性逐步恢复正常，但未完全消除影响。
　　3.研究了0.18、0.92和1.84 mg/L三个浓度水平戊唑醇曝露和清除对斑马鱼雌鱼HPG轴相关性激素和类固醇合成、代谢相关调控基因的影响。研究发现:(1)不同曝露浓度处理，可导致斑马鱼雌鱼血浆中E2含量呈下降趋势，且存在剂量-效应关系，而对雄激素T含量影响不大;净化清除阶段终止后，E2含量基本恢复至对照水平，而T含量仍旧变化不大。(2)戊唑醇曝露导致雌鱼vtg1、erβ、star、cyp17、cyp19a、cyp19b、hsd17b1、hsd17b3、lhr、fshr的基阻表达量显著下调(p＜0.05)。终止曝露，清水中饲养30d后，斑马鱼雌鱼处理组肝脏组织中，vtg1与对照组相比无显著差异;卵巢中erα和star除1.84mg/L组依然显著下调外，其余各组已基本恢复正常;erβ的基因表达量各组显著下调(p＜0.01);0.92和1.84 mg/L组cyp11a显著上调;cyp17、cyp19b、hsd17b3、lhr和fshr基因表达量各浓度组与对照相比均显著上调。
　　4.研究了戊唑醇曝露和清除对亲代产卵量和子代发育的影响。研究发现戊唑醇的曝露使得F0代平均产卵量显著下降，子代胚胎孵化时间延迟，幼鱼的畸形率提高。当终止曝露转入清水净化清除饲养30 d后，F0代平均产卵量依然显著下降，子代胚胎孵化时间和对照相比无差异性，子代畸形率仍显著高于对照组。结果显示曝露产生的干扰效应有可能通过亲代斑马鱼的繁殖活动传递给子代。
　　5.雌鱼卵巢病理学切片检查发现，戊唑醇曝露后，斑马鱼卵巢未发现明显的病理学改变，但对斑马鱼卵细胞的发育产生了影响。戊唑醇不同浓度(0.18，0.92，1.84 mg/L)28 d曝露，使得初级卵母细胞(PO)百分比和对照相比分别显著增加了4.99％，10.05％和14.48％(p＜0.05);成熟的卵母细胞(LMO)百分比和对照相比分别显著减少了21.62％，25.38％和28.13％(p＜0.01)。净化清除30 d后，斑马鱼卵巢未发现明显的病理学改变，各处理组PO百分比和对照相比分别显著减少了9.44％，7.41％和10.18％(p＜0.05); LMO百分比和对照组相比无显著性差异。卵巢病理学切片检查为戊唑醇曝露影响亲代产卵量提供了生理学依据。
　　综上所述，戊唑醇为中等富集性农药，在斑马鱼体内不易被代谢掉，长期低浓度的曝露会导致斑马鱼HPG轴内分泌干扰效应，并给斑马鱼亲代繁殖和子代发育带来不利影响，且这种影响可能具有子代传递性，在终止接触后仍会延续，且短期内不能恢复和消除。研究初步证实戊唑醇可能具有抗雌激素样作用，其机制可能是戊唑醇通过抑制cyp19表达，进一步导致E2下调，从而发挥其抗雌激素作用。

目录

声明

术语和缩略语表

摘要

第一章 绪论

1．1 环境内分泌干扰物概述

1．1．1 环境内分泌干扰物定义

1．1．2 环境内分泌干扰物分类

1．1．3 环境内分泌干扰物分布及危害

1．1．4 环境内分泌干扰物作用特点

1．1．5 环境内分泌干化物的作用机理

1．2 农药作为环境内分泌干扰物的研究

1．2．1 农药作为环境内分泌干扰物的特点

1．3 斑马鱼作为实验动物在环境内分泌干扰物中的应用

1．3．1 斑马鱼生物学特点

1．3．2 利用斑马鱼开展内分泌干扰评价的方法

1．3．3 鱼类内分泌系统的特点

1．4 杀菌剂戊唑醇的毒理学研究进展

1．4．1 戊唑醇的使用现状

1．4．2 戊唑醇的毒理学研究进展

1．5 论文研究主要内容和意义

1．5．1 研究目的和意义

1．5．2 研究内容

第二章 戊唑醇在斑马鱼体内的富集性、分布及持留性

2．1 引言

2．2 材料和方法

2．2．1 供试药剂

2．2．2 仪器与设备

2．2．3 试验用鱼和水

2．2．4 试验方法

2．3 结果与分析

2．3．1 标准曲线与线性范围

2．3．2 方法的准确度和精密度

2．3．3 戊唑醇在斑马鱼体内的生物富集性

2．3．4 富集平衡后戊唑醇在斑马鱼不同组织和器官的分布

2．4 讨论和小结

2．4．1 讨论

2．4．2 小结

3．1 引言

3．2 材料和方法

3．2．1 供试药剂

3．2．2 主要仪器及设备

3．2．3 试验用鱼及处理方法

3．3 结果与分析

3．3．1 曝毒处理组抗氧化酶系测定

3．3．2 清除组斑马鱼抗氧化酶系的测定

3．4 讨论与结论

3．4．1 讨论

3．4．2 小结

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 供试药剂

4．2．2 主要仪器及设备

4．2．3 试验用鱼

4．2．4 成鱼28天染毒试验

4．2．5 成鱼28天染毒后的子代传递毒性

4．2．6 30天清除试验

4．2．7 成鱼28天短期染毒后转入清水清除30天子代的传递毒性

4．2．8 类固醇激素和戊唑醇测定

4．2．9 qRT-PCR测定基因表达量

4．2．10 性腺组织切片

4．3 结果与分析

4．3．1 曝毒试验结果与分析

4．3．2 清除试验结果与分析

4．4 讨论与小结

4．4．1 讨论

4．4．2 小结

全文总结

总结

论文创新点

不足与展望

参考文献

作者简历及读研期间取得的科研成果

致谢

附录