土壤-蔬菜系统中四环素类抗生素迁移积累与污染的细胞诊断方法

摘要

四环素类抗生素(TCs)是世界范围内用量最大的抗生素之一，其环境污染的生态毒性越来越多的受到关注。我国土壤类型复杂，掌握不同类型土壤-蔬菜系统中四环素类抗生素的毒性效应和迁移积累规律，建立土壤-蔬菜系统安全风险评估模型，对于了解和控制土壤-蔬菜-食物链系统中四环素类抗生素污染的危害具有一定的意义。本研究采用水培和土培等方法，运用酶联免疫法、透射电镜、荧光显微镜、流式细胞术等技术手段结合体外细胞模型，研究了土壤-蔬菜系统中四环素类抗生素的毒性效应和迁移积累规律，建立了四环素类抗生素污染的细胞诊断方法。取得的主要研究结果如下:
　　1.采用水培法和土培试验结合酶联免疫(ELISA)方法检测，研究了不同土壤中四环素类抗生素污染对小白菜根系生长发育的影响，和四环素类抗生素在土壤中的降解特性。结果表明，小白菜对3种抗生素的敏感性为根长＞发芽率＞生物量，且水培条件下3种抗生素对小白菜的毒性为金霉素＞土霉素＞四环素，毒性均大于同浓度时土培条件的。抗生素处理土壤30 d时，4种土壤中小白菜根长对3种抗生素胁迫的敏感性均为砖红壤＞红壤＞青紫泥＞黑土;同种抗生素在4种土壤中的降解率为黑土＞青紫泥＞红壤＞砖红壤，同种土壤中3种抗生素的降解率为土霉素＞金霉素＞四环素。相关性分析发现土壤中四环素类抗生素的含量与土壤有机质，氮磷钾含量和阳离子交换量呈极显著负相关。说明越是肥沃的土壤，四环素类抗生素降解率越大，对蔬菜作物的毒性也越弱。
　　2.利用体外人肝细胞HL-7702，结合透射电镜，荧光显微镜和流式细胞术研究了四环素类抗生素对肝细胞的毒性机制。结果表明，在0-50 mg L-1的浓度范围内，随着四环素类抗生素浓度的增加，HL-7702细胞增殖和胞外的超氧化物歧化酶(SOD)活性逐渐下降，而胞外的乳酸脱氢酶(LDH)，谷丙转氨酶（ALT），谷草转氨酶(AST)，过氧化物酶(POD)活性和过氧化氢(H2O2)和丙二醛(MDA)含量则逐渐升高，肝细胞线粒体嵴和粗面内质网发生肿胀，核糖体脱落明显，脂滴产生，产生了肝细胞晚期凋亡。四环素类抗生素可以导致HL-7702细胞产生肝细胞毒性，且毒性大小为金霉素＞土霉素＞四环素。表明氧化应激、线粒体损伤和细胞凋亡是四环素类抗生素肝毒性的主要机制，LDH，ALT，AST，SOD，POD， H2O2，MDA和细胞凋亡可作为指示四环素类抗生素肝毒性的生物标志物。
　　3.采用盆栽试验，运用ELISA方法检测探讨了四环素类抗生素在土壤-白菜系统中的迁移积累规律，并建立了相应的暴露评估模型。结果表明，土壤中的四环素、土霉素和金霉素迁移进入了小白菜的根系，而只有四环素和金霉素转移进入了小白菜的叶片，积累量的大小为四环素＞金霉素＞土霉素。根系和叶片四环素和金霉素的积累量随着土壤抗生素浓度的增加而增加，且积累量为叶片＞根系，对于不同土壤而言，长时间处理的小白菜根系和叶片中四环素和金霉素的积累量均为青紫泥＞黑土。通过暴露评估模型计算得出土壤-白菜系统中四环素、土霉素和金霉素的风险商均小于1，且四环素＞金霉素＞土霉素。说明在一定的浓度范围内，仅通过土壤迁移进入小白菜途径摄入的单一的四环素类抗生素是不会对人体健康造成风险的。
　　4.采用盆栽试验，运用HL-7702细胞模型结合体外消化法，ELISA方法检测，透射电镜和流式细胞术等技术，建立土壤-蔬菜系统中四环素类抗生素污染的细胞诊断方法。结果表明，青紫泥土壤较之黑土中小白菜叶片中四环素和金霉素的浓度更高，采用模拟胃肠反应的体外消化法，进一步证明青紫泥较之黑土上的小白菜对肝细胞有更大的细胞毒性，生食小白菜较之熟食的肝细胞毒性也会增强，可以导致细胞膜完整性受到破坏，肝功能酶活性的升高，氧化胁迫加重，线粒体和内质网受损，进一步引起肝细胞的早期凋亡，造成肝细胞的损伤。肝细胞的毒性随着四环素抗生素的浓度的升高而增加，且长时间条件下毒性大小为四环素≈金霉素＞土霉素。说明肥沃的土壤上生长的小白菜四环素类抗生素的毒性可能更小，且在小白菜叶片中四环素类抗生素浓度较低的条件下，熟食白菜较之生食白菜对人体健康更安全。体外人肝细胞可以作为一种工具来诊断四环素类抗生素在土壤-蔬菜系统中的污染程度。

目录

声明

论文说明

致谢

摘要

荚汉缩略词对照表

第1章 文献综述

1．1 土壤四环素类抗生素的污染现状

1．1．1 四环素类抗生素的性质与用途

1．1．2 四环素类抗生素污染的来源与危害

1．2 土壤中四环素类抗生素污染的生态毒性

1．3 四环素类抗生素的肝毒性

1．4 土壤中四环素类抗生素的迁移转化

1．4．1 土壤中四环素类抗生素的吸附与解吸

1．4．2 土壤中四环素类抗生素的降解及形态

1．5 植物对四环素类抗生素的积累与分布

1．6 四环素类抗生素污染土壤健康风险评估与诊断方法

1．6．1 环境中四环素类抗生素的污染标准

1．6．2 土壤四环素类抗生素污染的评估与诊断

1．7 研究的目标与内容

1．7．1 研究目的与意义

1．7．2 主要研究内容

1．8 技术路线

第2章 四环素类抗生素对土壤中小白菜生长发育的影响

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 供试植物和土壤

2．2．2 主要试剂

2．2．3 发芽试验

2．2．4 盆栽过程和试验设计

2．2．5 数据统计分析

2．3 结果与分析

2．3．1 水培发芽试验

2．3．2 盆栽小白菜根长试验

2．4 讨论

2．5 结论

第3章 四环素类抗生素对体外人肝细胞HL-7702的毒性损伤

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 供试细胞株

3．2．2 细胞培养和处理

3．2．3 细胞增殖测定

3．2．4 细胞毒性的测定

3．2．5 肝细胞超微结构观察

3．2．6 细胞凋亡检测

3．2．7 数据统计分析

3．3 结果与分析

3．3．1 四环素类抗生素对人肝细胞HL-7702增殖的作用

3．3．2 四环素类抗生素对人肝细胞HL-7702乳酸脱氢酶的影响

3．3．3 四环素类抗生素对人肝细胞HL-7702肝功能酶的影响

3．3．4 四环素类抗生素对人肝细胞HL-7702氧化胁迫的影响

3．3．5 四环素类抗生素对人肝细胞HL-7702超微结构的影响

3．3．6 四环素类抗生素处理的HL-7702细胞形态的变化

3．3．7 四环素类抗生素对HL-7702细胞凋亡的影响

3．4 讨论

3．5 结论

第4章 四环素类抗生素在土壤-白菜中的迁移积累与风险评估

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 供试植物和土壤

4．2．2 盆栽过程和试验设计

4．2．3 植物收获

4．2．4 植物和土壤抗生素分析

4．2．5 数据统计分析

4．3 结果与分析

4．3．1 土壤四环素类抗生素对小白菜根系和地上部生物量的影响

4．3．2 土壤中小白菜根系与叶片四环素类抗生素的积累量

4．3．3 四环素类抗生素在土壤中的降解

4．3．4 四环素类抗生素污染在土壤-白菜系统中的风险评价

4．4 讨论

4．5 结论

第5章 土壤-白菜中四环素类抗生素污染的细胞诊断方法

5．1 引言

5．2 材料与方法

5．2．1 供试植物和土壤

5．2．2 盆栽过程和试验设计

5．2．3 植物收获

5．2．4 体外消化法处理小白菜

5．2．5 体外消化液中抗生素含量测定

5．2．6 细胞培养和处理

5．2．7 细胞增殖测定

5．2．8 细胞毒性测定

5．2．9 肝细胞超微结构观察

5．2．10 细胞凋亡检测

5．2．11 数据统计分析

5．3 结果与分析

5．3．1 土壤四环素污染细胞诊断方法的建立

5．3．2 土壤土霉素污染细胞诊断方法的建立

5．3．3 土壤金霉素污染的细胞诊断方法的建立

5．4 讨论

5．5 结论

第6章 综合结论、创新点及研究展望

6．1 综合结论

6．2 创新点

6．3 研究展望

参考文献

博士期间主要学术成果