新型树枝状大分子造影剂的制备与生物成像研究

摘要

肿瘤成像是肿瘤诊断过程中重要技术手段。目前常用的人体肿瘤成像技术中，磁共振成像(MRI)因无辐射、无创伤和软组织分辨率高等优点被广泛应用，为肿瘤诊断技术的进步提供了巨大的帮助。但是MRI对肿瘤的成像灵敏度不够理想，需要使用造影剂提高肿瘤成像的对比度。目前临床上使用的大多数造影剂为小分子钆配合物，其结构简单，安全性好，但弛豫率低，清除速度过快，缺乏肿瘤靶向性，无法满足肿瘤临床诊断的要求。因此，目前亟需发展高弛豫率、长循环和肿瘤靶向的新型造影剂，提高MRI诊断肿瘤的灵敏度。将纳米载体与MRI造影剂相结合能够提高造影剂的驰豫和靶向性能。在各类纳米载体中，树枝状大分子具有结构明确、分布均一、表面基团多等优点，是一种理想的纳米载体材料。但是，目前树枝状大分子存在合成复杂、生物相容性差和缺乏抗蛋白吸附能力易被网状内皮系统清除等问题，限制了它们作为生物载体材料的应用。
　　据此本文以多官能团化合物环糊精为核，构建了两种新型的聚甘油树枝状大分子和内部羟基化的树枝状大分子，解决了高分子量树枝状大分子合成困难的问题，并通过引入避免非特异性黏附的两性离子和肿瘤靶向基团，获得了肿瘤靶向的树枝状大分子造影剂。首先，论文以β-环糊精为核、卤代丙烯为单体，通过交替进行的Willaims和Sharpless反应合成了1-4代聚甘油树枝状大分子CPGD，并利用1H NMR、凝胶渗透色谱和MALTI-TOF-MS对其结构进行了表征。该树枝状大分子以甘油醚为结构单元结构稳定，生物相容性好。与小分子为核的聚甘油树枝状大分子相比，树枝状大分子的分子量从原来最高的5.1kDa增加到18.9kDa，表面功能团从原来的48个增加到168个。通过带双键基团的树枝状大分子与不同带巯基团的化合物反应，合成了表面带羟基、胺基、羧基和两性离子等不同基团的树枝状大分子，研究了不同表面基团对并对其的毒性、与蛋白的相互作用、细胞内吞以及器官分布的影响，发现表面带有氨基的CPGD毒性过大，生物相容性差，带羧基的GPGD在肿瘤中分布多，但细胞毒性较大且不易进入细胞，G3-OH进细胞速度快，但排出过快，而带两性离子CPGD在正常pH7.4下不与蛋白相互作用，在肿瘤的酸性pH下会与蛋白相互作用，而通过内吞作用较快的进入细胞，且能够从酸性的溶酶体逃逸，具有更好肿瘤药物/造影剂输送性能。
　　然后，论文在两性离子的聚甘油树枝状大分子表面引入造影剂分子，获得的聚甘油树枝状大分子造影剂。该造影剂的驰豫率随大分子的代数增加而逐代增大，CPGD-G3-DOTA-Gd的弛豫率为14.3 mM-1s-1，约为Magnevist的3.3倍。两性离子修饰的聚甘油树枝状大分子造影剂能够显著降低细胞内吞，可以作为细胞外造影剂较少造影剂在体内的残留。ICR白鼠的活体成像证明了这种造影剂有很好的血池造影能力，相对Magnevist可以在较长的时间内维持对血池的增强效果，同时对血管丰富器官也有较好的增强效果，其中高代数的树枝状大分子造影剂相较于低代数具有更长的体内循环时间和更好的造影效果，而且造影剂几乎没有长期的治疗，能够避免造影剂滞留和代谢造成的系统毒性。除此之外，论文在聚甘油树枝状大分子造影剂的表面通过PEG链接引入了肿瘤厌氧靶向基团，获得了肿瘤靶向的树枝状大分子造影剂，其弛豫率为Magnevist的6.9倍，并能够在肿瘤的缺氧区域富集，显著增强肿瘤与正常区域的对比。
　　最后，为了避免树枝状大分子表面引入造影剂破坏树枝状大分子两性离子性质。论文还以环糊精为核，通过交替进行“amine-epoxy”的开环反应和“thiol-allyl”反应合成了一种内部羟基化的树枝状大分子，并利用1H NMR、凝胶渗透色谱对其结构进行了表征。同时，在这种树枝状大分子的内部连接造影剂，而在其表面引入两性离子与肿瘤靶向的苯磺胺基团，获得了一种新型的肿瘤靶向树枝状大分子造影剂。其中，两性离子能够避免非特异性蛋白粘附和细胞内吞，而表面的肿瘤靶向基团能够介导肿瘤细胞特异性内吞树枝状大分子造影剂，提高造影剂的肿瘤靶向性能。该造影剂的粒径约为6.2nm，驰豫速率11.3 mM-1s-1，约为Magnevist的2.7倍。细胞实验表明该造影剂具有肿瘤厌氧靶向性能，动物实验表明该肿瘤靶向树枝状大分子造影剂显著增强肿瘤的磁共振成像，并能够快速的通过肾脏排出体外，无明显的系统毒性，是一种理想的肿瘤靶向型造影剂。

目录

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致谢

缩写索引

摘要

第一章 绪论

1．1 肿瘤影像诊断

1．2 树枝状大分子与其生物应用

1．2．1 树枝状大分子简介

1．2．2 树枝状大分子的合成

1．2．3 树枝状大分子的应用

1．2．4 树枝状大分子面临的挑战

1．3 磁共振成像及其造影剂树枝状大分子磁共振造影剂

1．3．1 磁共振成像的原理

1．3．2 造影剂

1．3．3 小分子磁共振造影剂

1．3．4 大分子造影剂

1．3．5 树枝状大分子造影剂

1．3．6 肿瘤靶向磁共振造影剂

1．4 肿瘤微环境及其靶向

1．4．1 肿瘤血管的特点与EPR效应

1．4．2 主动靶向

1．5 论文的选题思路

第二章 环糊精为核的聚甘油树枝状大分子合成与表面修饰

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 化学试剂和仪器

2．2．2 聚甘油树枝状大分子的合成与表面修饰

2．2．3 不同表面基团树枝状大分子与血清蛋白的共作用

2．2．4 不同表面基团聚甘油树枝状大分子的细胞毒性实验

2．2．5 激光共聚焦测定不同表面基团聚甘油树枝状大分子的细胞吞噬实验

2．2．6 荷瘤裸鼠模型的建立和荧光检测体内分布

2．3 结果与讨论

2．3．1 聚甘油树枝状大分子的合成与表征

2．3．2 聚甘油树枝状大分子的表面修饰

2．3．3 不同表面基团树枝状大分子的细胞毒性实验

2．3．4 不同表面基团树枝状大分子的细胞吞噬实验

2．3．5 G3-Cys与G3-OH与血浆蛋白在不同pH下的相互作用

2．3．6 不同表面基团树枝状大分子的组织分布

2．4 小结

第三章 两性离子表面的聚甘油树枝状大分子造影剂合成与表征

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 化学试剂和仪器

3．2．2 树枝状大分子造影剂的合成

3．2．3 树枝状大分子造影剂Gd含量与弛豫率的测定

3．2．4 细胞毒性实验

3．2．5 细胞吞噬实验

3．2．6 肝脏分布实验

3．2．7 小鼠成像实验

3．2．8 10天体内残留

3．3 结果与讨论

3．3．1 树枝状大分子造影剂Gd含量以及弛豫率测定

3．3．2 CPGD-G3-Cys与PAMAM的细胞毒性

3．3．3 CPGD-G3-Cys与PAMAM的细胞内吞

3．3．4 CPGD-G3-Cys与PAMAM的肝脏分布

3．3．5 小鼠磁共振成像

3．3．6 树枝状大分子造影剂小鼠Gd体内残留

3．4 小结

第四章 肿瘤靶向聚甘油树枝状大分子造影剂的制备与成像研究

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 实验材料及仪器

4．2．2 肿瘤靶向聚甘油树枝状大分子造影剂的合成

4．2．3 PEG-G3-DTPA-Gd的表征

4．2．4 小鼠肿瘤磁共振成像

4．3．结果与讨论

4．3．1 肿瘤靶向聚甘油树枝状大分子造影剂的合成与表征

4．3．2 树枝状大分子造影剂的粒径表征

4．3．3 大分子造影剂的Gd含量和弛豫率

4．3．4 小鼠肿瘤磁共振成像

4．4 小结

第五章 内外双功能化树枝状大分子造影剂的制备与肿瘤造影

5．1 引言

5．2 实验部分

5．2．1 实验材料及仪器

5．2．2 内部羟基化的树枝状大分子的合成与表征

5．2．3 CAIX靶向树枝大分子造影剂的表征

5．2．4 CAIX靶向树枝大分子造影剂的缺氧细胞内吞

5．2．5 肿瘤模型的建立

5．2．6 靶向大分子造影剂的体内成像

5．3 结果与讨论

5．3．1 树枝状大分子IHD-Gn的合成与表征

5．3．2 IHD-Gn-ENE的GPC表征

5．3．2 肿瘤靶向树枝状大分子造影剂的合成与1H NMR表征

5．3．3 肿瘤靶向树枝状大分子造影剂IHD-G3(DTPA-Gd)-Cys-SA的性能

5．3．4 IHD-G3(DTPA-Gd)-Cys-SA的细胞内吞结果

5．3．5 小鼠肿瘤磁共振成像实验

5．4 小结

第六章 树枝状大分子造影剂组装的初步研究

6．1 引言

6．2 实验部分

6．2．1 实验材料及仪器

6．2．2 SA-PEG-G3-DTPA-Gd与疏水分子的组装

6．2．3 IHD-G3(DTPA-Gd)-SA与顺铂的组装

6．3 结果与讨论

6．3．1 疏水性功能小分子诱导SA-PEG-G3-DTPA-Gd

6．3．2 Cisplatin@IHD-G3(DTPA-Gd)-SA复合物的制备与表征

6．3．3 pH响应型造影剂IHD-G3(DTPA-Gd)-Pip的合成和组装

6．4 小结

第七章 总结与展望

参考文献

博士期间发表的论文