利用双亲性药物制备难溶药物的新型纳米制剂的研究

摘要

化学治疗目前仍是不可或缺的癌症治疗手段，但化疗药物多为疏水性药物，血液清除快，且缺乏对肿瘤部位的靶向性，导致疗效差、毒副作用大。以纳米材料为载体的抗肿瘤药物输送系统，即抗肿瘤纳米药物，是解决上述问题的有效途径。纳米药物克服了许多小分子药物的缺点，如可以显著提高难溶药物的溶解度，减慢药物的清除速率，以及降低毒副作用。
　　纳米药物的临床转化仍面临着重大挑战。一方面，许多纳米药物用的载体材料还未被批准为注射用辅料，其各种生物毒性和体内代谢等问题需要花费大量的人力和物力进行阐明，限制了纳米药物的临床转化。另一方面，载体的设计及制备过程过于注重多功能化，而忽视了临床应用的可能性。分析目前已临床应用的药物，发现其中许多药物分子本身具有双亲性，例如，伊立替康(CPT11)有亲水的哌啶环和疏水的喜树碱稠环结构。为此，我们提出:直接利用双亲性的药物分子作为乳化剂来分散疏水性药物、制备纳米制剂，可避免使用未被批准临床应用的材料，从而使制备的纳米制剂更加易于临床转化。
　　基于此，在本论文第一部分中，我们以解决疏水性的化疗药物7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)的体内输送为出发点，以SN38的前药分子CPT11作为乳化剂，制备了CPT11/SN38纳米制剂，将SN38的水溶性提高了上千倍，可达到25 mg/mL，载药效率几乎为100％。通过一系列的性状表征及体内外毒性实验，证明CPT11/SN38纳米颗粒保留了药物本身的高抗肿瘤活性特点，抑瘤效果明显优于小分子伊立替康。
　　进一步地，我们对CPT11/SN38纳米制剂的临床转化过程中遇到的问题进行了详细的研究。单纯的SN38不容易进行物理包埋和剂型制备，而添加少量CPT11破坏其结晶后，可采用多种方法对其进行修饰和包载，从而降低其表面电荷，提高颗粒的稳定性，进而改善了其药代动力学。利用这种方式制备的维生素E聚乙二醇琥珀酸酯/SN38纳米颗粒相较于CPT11/SN38表现出更好的抑瘤效果。同时，我们改良了纳米颗粒的制备方法，利用SN38内酯环在碱性条件下开环溶于水，而在酸性条件下闭环回到疏水结构的特点，实现了零有机溶剂的制备方法，避免了纳米制剂制备过程中有机溶剂的使用及残留问题。
　　第二部分工作借鉴上述方法制备了姜黄素(CCM)纳米制剂。姜黄素对多种肿瘤细胞的产生、增殖、转移均有抑制作用，其抗肿瘤谱广、毒性低，是一种具有广阔开发前景的化疗药物。然而由于其水溶性极差且极易分解，导致了生物利用度极低，大大限制了姜黄素的应用。我们分别使用光敏剂吲哚菁绿(ICG)、化疗药物盐酸阿霉素(DOX)或者CPT11增溶姜黄素，得到了ICG/CCM水溶液，以及DOX/CCM及CPT11/CCM纳米颗粒。进一步对DOX/CCM和CPT11/CCM纳米颗粒进行了细胞实验以及初步的小鼠抑瘤实验，结果表明，姜黄素与化疗药物形成的纳米制剂的抑瘤效果优于两种药物分别给药，且可以降低化疗药物的毒副作用。
　　第三部分工作开发了可应用于光疗和化疗联合治疗的ICG/SN38纳米制剂。光敏剂ICG分子是有两个磺酸基团的，带有负电荷的大共轭结构，也具有双亲性，因而ICG可以增溶许多疏水化疗药物，如紫杉醇、姜黄素、8-羟基喹啉等，形成水溶液或者纳米制剂。同时，我们发现化疗药物的加入可以减少ICG分子间的淬灭，增强其荧光强度和光敏性。ICG/SN38纳米颗粒的体内外的毒性结果表明，联合治疗对细胞的杀伤能力优于单独的光疗或化疗。另外，所获得的复合纳米颗粒与小分子ICG相比，具有更长的血液循环时间和更高的肿瘤富集，ICG/SN38纳米颗粒的协同治疗可以实现小鼠肿瘤完全消失。
　　第四部分工作是利用罗丹明异硫氰酸酯进行实体肿瘤及转移瘤的检测。我们通过对比不同荧光染料在活体成像时的现象，发现罗丹明异硫氰酸酯可以在体内正常器官处淬灭，而特异性地在实体瘤显色;除了实体瘤，也可以检测移植瘤的发展和病变恶化程度。接着，我们分析了罗丹明异硫氰酸酯的分子结构，发现小分子罗丹明或者将硫脲基团反应掉后，这种特性消失;进一步建立了苯肼诱导的小鼠溶血模型和亚砷酸钠诱导的急性肝损伤模型，分析了特异性淬灭和复亮的原因。

目录

声明

致谢

摘要

英文缩略词表

第一章 绪论

1．1 引言

1．2 纳米药物

1．2．1 纳米药物的定义与发展

1．2．2 纳米药物的特点

1．3 化学疗法

1．3．1 化疗药物

1．3．2 拓扑异构酶Ⅰ型抑制剂

1．3．3 疏水药物7-乙基-10-羟基喜树碱

1．4 光动力及光热疗法

1．4．1 光疗及光敏剂

1．4．2 吲哚菁绿

1．5 联合治疗

1．5．1 多种化疗药物联合治疗

1．5．2 化疗药物与化疗增敏剂联合治疗

1．5．3 化疗药物与其他治疗手段的联合治疗

1．6 纳米技术的临床转化

1．7 课题的提出及研究内容

第二章 双亲药物为乳化剂制备无辅料型纳米制剂

2．1 引言

2．2 实验材料与仪器

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验仪器

2．2．3 细胞系及实验动物

2．3 实验方法

2．3．1 药物含量测定

2．3．2 SN38／CPT11纳米颗粒的制备

2．3．3 纳米颗粒的粒径分布和Zeta电位测定

2．3．4 透射电镜观察纳米复合物的形态

2．3．5 扫描探针显微镜观察纳米复合物的形态

2．3．6 X-射线衍射研究

2．3．7 差示扫描量热仪

2．3．8 药物冻干实验

2．3．9 纳米颗粒的增长特性

2．3．10 纳米颗粒旋光性与手性的检测

2．3．11 细胞毒性实验

2．3．12 药物的荧光标记

2．3．13 激光共聚焦显微镜观察纳米复合物的亚细胞分布

2．3．14 血浆清除

2．3．15 体内抑瘤实验

2．3．16 肿瘤和组织病理切片

2．4 结果与讨论

2．4．1 SN38／CPT11纳米颗粒的制备

2．4．2 SN38／CPT11纳来颗粒的粒径

2．4．3 SN38／CPT11纳米颗粒的形貌

2．4．4 其他纳米药物制剂的制备与形貌

2．4．5 SN38／CPT11纳米颗粒的冷冻干燥

2．4．6 药物的XRD和DSC表征

2．4．7 SN38／CPT11纳米颗粒的生长

2．4．8 SN38／CPT11纳米颗粒的旋光性

2．4．9 细胞毒性实验

2．4．10 细胞摄取及亚细胞分布

2．4．11 SN38／CPT11纳米颗粒的血浆清除

2．4．12 SN38／CPT11纳米颗粒的体内分布

2．4．13 体内抑瘤实验

2．4．14 化疗毒性实验

2．5 本章小结

第三章 临床转化型7-乙基-10-羟基喜树碱纳米制剂的研究

3．1 引言

3．2 实验材料与仪器

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验仪器

3．2．3 细胞系和实验动物

3．3 实验方法

3．3．1 制备方案一：SN38／CPT11的常规制备

3．3．2 制备方案二：SN38的辅料增溶法

3．3．3 制备方案三：SN38／CPT11的无有机溶液添加制备方法

3．3．4 纳米复合物的粒径分布和Zeta电位测定

3．3．5 细胞毒性实验

3．3．6 血浆清除实验

3．3．7 体内抑瘤实验

3．4 结果与讨论

3．4．1 SN38的辅料增溶法及粒径

3．4．2 SN38／CPT11的酸碱法制备和表征

3．4．3 体外抗癌细胞增殖实验

3．4．4 药物动力学实验

3．4．5 抗肿瘤活性试验

3．5 本章小结

第四章 姜黄素的纳米制剂及其与化疗药物的联合治疗

4．1 引言

4．2 实验材料与仪器

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验仪器

4．2．3 细胞系及实验动物

4．3 实验方法

4．3．1 姜黄素的增溶

4．3．2 纳米颗粒的粒径分布和Zeta电位测定

4．3．3 扫描探针显微镜观察纳米复合物的形态

4．3．4 细胞毒性实验

4．3．5 小鼠活体confocal实验

4．3．6 原发性肝癌抑制实验

4．3．7 荷瘤裸鼠的抑瘤实验

4．4 结果与讨论

4．4．1 TPGS增溶姜黄素的制备和表征

4．4．2 ICG增溶美黄素的制备和表征

4．4．3 化疗药物增溶姜黄素的制备和表征

4．4．4 细胞毒性实验

4．4．5 DOX／CCM纳米颗粒的亚细胞分布

4．4．6 小鼠的活体confocal实验

4．4．7 原发性肝癌实验

4．4．8 CPT11／CCM的荷瘤裸鼠抑瘤实验

4．5 本章小结

第五章 吲哚菁绿与化疗药物复合纳米制剂及其应用于联合治疗的研究

5．1 引言

5．2 实验材料与仪器

5．2．1 实验材料

5．2．2 实验仪器

5．2．3 细胞系及实验动物

5．3 实验方法

5．3．1 不同吲哚菁绿制剂的制备

5．3．2 药物含量检测方法

5．3．3 制剂的发热效果考察

5．3．4 制剂的粒径和形态学考察

5．3．5 制剂在溶液水平上的光热及光动力实验

5．3．6 细胞摄取定量实验

5．3．7 细胞摄取抑制实验

5．3．8 制剂在细胞水平上的光热及光动力实验

5．3．9 药物体外细胞毒性实验

5．3．10．血浆清除实验

5．3．11 体内抑瘤实验

5．3．12 肿瘤组织病理切片

5．4 实验结果

5．4．1 制剂的制备

5．4．2 制剂在溶液水平的光热和光动力效果

5．4．3 细胞吞噬实验

5．4．4 细胞内吞抑制剂对ICG制剂的细胞摄取的影响

5．4．5 药物的亚细胞分布研究

5．4．6 制剂在细胞水平上的光热和光动力效果

5．4．7 制剂的细胞毒性试验

5．4．8 血浆清除实验

5．4．9 荷瘤裸鼠的活体成像

5．4．10 制剂的体内分布

5．4．11 荷瘤裸鼠上的抑瘤实验

5．5 本章小结

第六章 罗丹明异硫氰酸酯的肿瘤特异性发光与其肿瘤早期检测的研究

6．1 引言

6．2 实验材料与仪器

6．2．1 实验材料

6．2．2 实验仪器

6．2．3 细胞系及实验动物

6．3 罗丹明相关化合物的合成

6．3．1 聚乙二醇化的荧光染料的合成

6．3．2 RBITC-PEG-Cy5．5 的合成

6．3．3 RBITC-SN38的合成

6．3．4 RB-SN38的合成

6．3．5 RBITC-PTX的合成路线

6．3．6 RBITC-PEG的修饰

6．4 实验方法

6．4．1 化合物的纯度确定和检测

6．4．2 纳米颗粒和水溶性药物的制备

6．4．3 动态光散射(DLS)测定纳米前药的尺寸

6．4．4 MTT法测定细胞毒性

6．4．5 体内分布与成像

6．4．6 裸鼠肿瘤模型的建立

6．4．7 裸鼠抑瘤实验

6．4．8 肿瘤组织病理切片

6．4．9 纳米药物的体内分布实验

6．4．10 激光共聚焦显微镜观察肺部转移灶分布

6．4．11 蛋白质电泳实验

6．4．12 血液处理与分析

6．4．13 K562细胞的红系分化

6．4．14 苯肼诱导的溶血小鼠模型

6．4．15 亚砷酸钠诱导的小鼠模型

6．4．16 血液分析

6．4．17 血细胞涂片

6．5 结果与讨论

6．5．1 不同荧光染料的活体成像

6．5．2 不同类型肿瘤上的验证

6．5．3 转移瘤模型上的活体成像

6．5．4 罗丹明前药的粒径分析

6．5．5 罗丹明前药的体外细胞毒性实验

6．5．6 罗丹明前药的体内分布实验

6．5．7 罗丹明前药的抑瘤实验

6．5．8 罗丹明异硫氰酸酯的结构修饰

6．5．9 K562细胞的红系分化

6．5．10 罗丹明异硫氰酸酯的淬灭与复亮

6．5．11 苯肼模型

6．5．12 亚砷酸钠模型

6．6 本章小结

第七章 结论与展望

参考文献

作者简历

在学期间所取得的科研成果

专利