用于肿瘤诊断治疗的透明质酸基多功能纳米粒子的研究

摘要

构建用于癌症快速诊断和治疗的多功能纳米粒子是肿瘤治疗领域的研究热点之一。透明质酸(HA)是细胞外基质的重要组成成分，具有非常好的生物相容性和体内可降解特性。此外，透明质酸可与多种癌细胞表面过度表达的CD44受体进行特异性结合，从而增加针对癌细胞的靶向作用，所以HA是一种非常好的表面修饰和药物载体材料。因此，本文选用HA作为主要原料，构建用于癌症诊断治疗的多功能纳米粒子，研究内容主要分为以下两个部分:
　　1.多功能纳米粒子在癌症的诊断治疗方面引起越来越多的关注。除了尺寸和表面化学特性之外，形貌是影响纳米粒子体内循环时间、生物分布、靶向性以及细胞内吞的重要因素。由于金纳米粒子具有无毒、可以简单地大量合成、表面易于修饰、特殊的光学特性等优点，能满足癌症诊断治疗的不同需求。本文首先合成金纳米杆（AuNRs）和金纳米球(AuNSs)来构建两种不同形貌的金纳米探针，其中AuNRs的长约50 nm，截面直径约为12nm，AuNSs直径约为20 nm。通过近红外光荧光染料尼罗蓝(NB)标记的巯基化透明质酸(HS-HA-NB)来包裹两种不同形貌的金纳米粒子，构建稳定的纳米探针AuNR@HS-HA-NB和AuNS@HS-HA-NB。由于透明质酸优异的生物相容性和体内可降解特性，纳米探针在不同pH磷酸缓冲液（pH=4-8）和80％浓度的血清中均表现出很好的稳定性，同时乳腺癌（MCF-7）细胞毒性实验表明在纳米探针表面包裹HS-HA-NB后，毒性显著降低。对比在MCF-7细胞内的成像结果发现，相对于球形探针，杆形探针可以更加快速地被细胞内吞并产生荧光，这可能是由于其长轴与细胞膜表面接触时能够提供更大的接触面积，因此可以快速有效地被细胞内吞。探针的HA靶向性也通过竞争抑制实验得到了验证。而且，在近红外光照后，加入金纳米杆探针的实验组细胞观测到了MCF-7细胞的凋亡。以上实验结果证明AuNR@HS-HA-NB纳米探针能够实现靶向快速准确成像和光热治疗。
　　2.化疗已经被广泛地应用于多种类型的癌症治疗当中，抗药性和缺乏癌细胞的靶向性是导致癌症化疗失败的主要因素。采用光热治疗产生的过高热来解除癌细胞的抗药性受到了广泛的关注。本文采用胱胺(Cys)交联的HA包裹AuNRs形成HA-Cys@AuNR纳米凝胶来负载阿霉素(DOX)，其载药量为0.5±0.017％，包封率为51.9±3.5％。并合成了不含有AuNRs的纳米凝胶HA-Cys，负载DOX后其载药量为0.5±0.014％，包封率为56.8±3.4％。由于Cys上存在二硫键，因此在GSH条件下，载药的HA-Cys@AuNR@DOX及HA-Cys@DOX纳米凝胶均能够有效的响应性释放DOX，4h药物释放量分别为69.9％和72.24％。细胞实验表明HA-Cys@AuNR@DOX及HA-Cys@DOX纳米凝胶均能对有效杀伤药物敏感的MCF-7细胞，但是对抗药性的MCF-7 ADR细胞却无明显效果。在HA-Cys@AuNR@DOX纳米凝胶对癌细胞治疗的过程中加入近红外光照射，AuNRs的光热作用能有效解除癌细胞的抗药性，造成MCF-7 ADR凋亡。通过荧光显微镜进一步研究发现，增加近红外光照后，细胞内部的DOX排出过程被抑制，使细胞的抗药性消失，这可能是由于抗药细胞在光热作用产生过高热的条件下，细胞膜通透性改变。在靶向性实验中，通过竞争抑制实验验证了纳米凝胶对MCF-7细胞的靶向性作用。采用HA成功制备了一种针对抗药性细胞的靶向性光热-药物协同治疗的多功能纳米凝胶。
　　本文采用的基于HA设计的纳米探针及纳米药物载体，为癌症诊断治疗多功能纳米粒子的研究提供了新的思路。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 绪论

1．1 透明质酸的概述

1．2 透明质酸在生物医学当中的应用

1．2．1 透明质酸在临床当中的应用

1．2．2 透明质酸在药物传递方面的应用

1．2．3 透明质酸纳米粒子在癌症诊断治疗方面的应用

1．3 增强纳米粒子癌症诊断治疗效果的方法

1．3．1 通过增加内吞作用来增强纳米粒子的癌症诊断治疗效果

1．3．2 通过消除癌细胞的抗药性来增强纳米粒子的癌症治疗效果

1．4 课题提出

1．4．1 透明质酸修饰的不同形貌生物探针的研究

1．4．2 光热-药物协同治疗的还原响应纳米凝胶的研究

第二章 透明质酸修饰的不同形貌生物探针的研究

2．1 实验部分

2．1．1 仪器与试剂

2．1．2 HS-HA-NB合成与表征

2．1．3 AuNSs和AuNRs合成与表征

2．1．4 合成HS-HA-NB修饰的不同形貌的金纳米探针

2．1．5 AuNR@HS-HA-NB和AuNS@HS-HA-NB的表征

2．1．6 不同形貌金纳米探针在不同pH条件下和血清中的稳定性

2．1．7 不同形貌金纳米探针的细胞毒性研究

2．1．8 金纳米探针的不同形貌及HA的靶向作用对细胞内吞行为的影响

2．1．9 不同形貌金纳米探针体外近红外光热治疗研究

2．2 结果与讨论

2．2．1 HS-HA-NB的合成及表征

2．2．2 AuNR@HS-HA-NB和AuNS@HS-HA-NB的合成与表征

2．2．3 不同形貌的纳米探针在不同pH条件下和血清中的稳定性研究

2．2．4 不同形貌金纳米探针的细胞毒性研究

2．2．5 金纳米探针的不同形貌及HA的靶向作用对细胞内吞行为的影响

2．2．6 不同形貌金纳米探针体外近红外光的光热治疗研究

2．3 本章小结

第三章 光热-药物协同治疗的还原响应透明质酸纳米凝胶的研究

3．1 实验部分

3．1．1 仪器与试剂

3．1．2 AuNRs的合成及表征

3．1．3 HA-Cys@DOX和HA-Cys@AuNR@DOX纳米凝胶的制备及表征

3．1．4 纳米凝胶的还原响应性药物释放行为的研究

3．1．5 纳米凝胶的药物及光热-药物协同作用下细胞毒性的研究

3．1．6 纳米凝胶在细胞内分布的研究

3．1．7 纳米凝胶的HA靶向性研究

3．2 结果与讨论

3．2．1 HA-Cys@DOX和HA-Cys@AuNR@DOX纳米凝胶的合成及表征

3．2．2 纳米凝胶的还原响应性药物释放行为的研究

3．2．3 纳米凝胶的药物及光热-药物协同作用下细胞毒性的研究

3．2．4 纳米凝胶在细胞内分布的研究

3．2．5 纳米凝胶的HA靶向性研究

3．3 本章小结

第四章 全文总结

4．1 全文结论

4．2 特色与创新

4．3 问题与展望

参考文献

作者简介