Pif1家族解旋机制的结构基础研究

摘要

Pif1蛋白是解旋酶SF1B超家族成员，能够利用ATP水解提供的能量，对双链DNA(dsDNA)，DNA/RNA杂合体，G4 DNA(G-quadruplex DNA)进行5'→3'方向的解旋，是生物体内非常重要的一类解旋酶。由于其结合底物的多样性，Pif1参与了细胞中多种生物学过程调控。Pif1可以通过解链端粒酶模板RNA与端粒DNA，使端粒酶从端粒游离下来，从而调控端粒的长度。在复制及转录过程中，Pif1能够迅速解开G4结构，维持基因组稳定性。Pif1还参与了冈崎片段的成熟及DNA损伤修复的BIR（Break-induced replication）通路，而且Pif1在核糖体DNA(ribosomal DNA，rDNA)的复制过程及线粒体基因组稳定性维持等方面也发挥了重要作用。
　　本文主要利用大肠杆菌表达系统，在体外分别构建了酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）ScPif1，人源hPif1，细菌（Bacteroides sp）BaPif1全长及对应的解旋酶结构域(Helicase domain，HD)截短。利用X光晶体衍射技术，解析了细菌BaPif1全长，人源hPif1-HD截短的单体结构，以及BaPif1与单链DNAdT10，与双链DNA dH的复合物晶体结构。对比单体结构与复合物结构发现BaPif1结合DNA后发生了显著的构象变化，2A、2B结构域分别发生了近20°、50°的旋转，并且这种构象变化对于Pif1行使解旋酶功能是必须的;BaPif1与双链DNAH复合物晶体结构显示结合的长链DNA在ssDNA/dsDNA junction处发生了近90°的弯曲，这有利于双链解旋。接着结合生物化学、生物物理、分子与细胞生物学方法对解析的结构进行深入分析，我们又阐述了Pif1家族所特有的signature motif在解旋过程中所起的作用，并提出了可能的解旋模型。本文研究不仅为Pif1维持基因组稳定性的作用提供重要依据，而且为抗肿瘤新药研究提供新的靶点和思路。

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摘要

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附表清单

缩写汇总

1 引言

1．1 解旋酶概述

1．1．1 什么是解旋酶?及其作用对象

1．1．2 解旋酶的分类及结构特征

1．1．3 解旋酶解旋机制研究

1．2 Pif1家族成员

1．2．1 酿酒酵母ScPif1及Rrm3

1．2．2 裂殖酵母Pfh1

1．2．3 人源hPif1

1．3 Pif1解旋酶的功能

1．3．1 Pif1对端粒稳定性的调控作用

1．3．2 Pif1对G4结构的解旋作用

1．3．3 Pif1促进损失修复的DNA合成

1．3．4 Pif1促进刚崎片段的成熟

1．3．5 Pif1维持线粒体基因组稳定性

1．3．6 Pif1调控rDNA的复制

1．4 本研究的意义与目的

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验试剂

2．1．3 实验仪器

2．2 方法

2．2．1 基因克隆

2．2．2 蛋白质表达与纯化

2．2．3 蛋白质单体结晶与结构解析

2．2．4 蛋白质／DNA复合物结晶与结构解析

2．2．5 蛋白质突变体克隆与纯化

2．2．6 蛋白质与核酸结合的EMSA实验

2．2．7 蛋白质与核酸结合的ITC实验

2．2．8 解旋酶活性测定实验

3 实验结果与讨论

3．1．1 ScPif1全长与Helicase domain(HD)截短的表达与纯化

3．1．2 hPif1全长与Heliease domain(HD)截短的表达与纯化

3．1．3 BaPif1全长的表达与纯化

3．2 Pif1蛋白及与DNA复合物的晶体衍射数据收集

3．2．2 BaPif1蛋白晶体衍射数据收集

3．2．3 BaPif1蛋白与单链DNA dT10的复合物晶体衍射数据收集

3．2．4 BaPif1蛋白与双链DNAH的复合物晶体衍射数据收集

3．3 Pif1蛋白及与DNA复合物的结构分析

3．3．1 Pif1单体结构分析

3．3．2 BaPif1／DNA复合物结构分析

3．3．3 Pif1-like解旋酶结构比对

3．4 BaPif1蛋白的Signature motif功能与解旋酶机制分析

3．4．2 BaPif1蛋白结合DNA后构象的变化

3．4．3 BaPif1蛋白可能的解旋机制

4 总结与展望

4．1 总结

4．2 展望

参考文献

个人简历及科研成果