中药疫苗稀释剂提高猪伪狂犬和猪瘟弱毒疫苗的免疫效果研究

摘要

传染病是威胁养猪业健康发展的危害因素之一。伪狂犬病(Pseudorabies，Pr)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PrV))引起的一种高度接触性动物传染病。Pr对养猪业的危害很大，15日龄以内仔猪感染后死亡率高达100％，断奶仔猪发病后死亡率约10～20％。猪瘟(Classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的另一种烈性传染病，对中国养猪业造成重大经济损失。目前中国广泛采用弱毒疫苗接种的方法来控制Pr和CSF，疫苗使用前一般须要经过生理盐水稀释才能注射动物。但在很多情况下疫苗不能有效地激发机体产生理想的免疫应答而导致免疫失败。因此，本论文拟研究具有免疫增强作用的疫苗稀释剂以提高伪狂犬弱毒(attenuated pseudorabies virus，aPrV)疫苗和猪瘟弱毒疫苗的免疫效果，为临床应用提供参考。
　　1.疫苗稀释剂配方的研究
　　目的:筛选合适的aPrV疫苗免疫增强剂配方。方法:以ICR小鼠为模型，免疫aPrV疫苗，以血清特异性PrV gB抗体为指标，评价白术多糖（RAMPS）和人参茎叶皂苷(GSLS)的免疫增强作用;以血清PrV gB、PrV gB IgG1、PrV gB IgG2a和攻毒保护为指标，评价候选稀释剂配方的免疫增强效果。结果:GSLS、RAMPS和硫柳汞(TS)均能增强小鼠血清PrV gB抗体水平，以GSLS的免疫增强作用最好。GSLS联合RAMPS没有协同作用，GSLS联合TS表现出协同作用，以GSLS-TS（6μg-1μg）的免疫增强效果最为显著。该配方能提前促进血清PrV gB、PrV gB IgG1和PrV gB IgG2a抗体的产生，并能在较长时间维持抗体在较高水平。伪狂犬野毒攻毒后，含GSLS-TS的稀释剂疫苗组小鼠的存活率明显高于生理盐水稀释疫苗组（70％vs40％）。
　　2.灭菌方法和贮存条件对GSLS-TS免疫活性的影响
　　目的:观察灭菌方法和贮存条件对GSLS-TS免疫增强作用的影响。方法:以ICR小鼠为模型，分别用不同灭菌方法处理的GSLS溶液和不同贮存条件下保存1年的GSLS-TS溶液稀释aPrV疫苗后免疫小鼠，以血清特异性抗体水平为指标，评价灭菌方法和贮存条件对GSLS-TS免疫增强作用的影响。结果:高温(100～121℃)处理和光照均会显著降低GSLS-TS的免疫增强效果。因此，GSLS-TS溶液不宜高温灭菌，并适合在低温避光条件下保存。
　　3.GSLS-TS和其它6种商品稀释剂佐剂作用的比较
　　目的:将GSLS-TS溶液与6个厂家的aPrV疫苗专用稀释剂进行效果对比。方法:以ICR小鼠为模型，周GSLS-TS溶液稀释6个不同厂家的aPrV疫苗，并与它们各自的专用疫苗稀释剂和生理盐水进行对比，以血清特异性抗体水平为指标。结果:除“晶制”厂家的稀释剂外，其它厂家的疫苗稀释剂免疫增强作用不明显，与生理盐水相比没有显著的差异。GSLS-TS溶液的免疫增强作用显著优于生理盐水和6种专用疫苗稀释剂。
　　4.GSLS-TS提高猪对Pr和CSF弱毒疫苗的抗体反应研究
　　目的:通过本动物试验观察GSLS-TS对猪弱毒疫苗的免疫增强作用。方法:用GSLS-TS溶液分别稀释Pr和CSF弱毒疫苗后免疫猪，以血清特异性抗体水平为指标，评价GSLS-TS对疫苗诱导体液免疫的影响。结果:GSLS-TS能同时促进猪对Pr和CSF两种弱毒疫苗的体液免疫反应，显著促进血清特异性抗体、抗体亚类和中和抗体滴度。
　　5.GSLS-TS对细胞免疫的影响
　　目的:评价GSLS-TS对疫苗诱导的细胞免疫的影响。方法:用GSLS-TS溶液稀释aPrV疫苗后免疫小鼠，24h后检测脾脏中NK细胞的杀伤活性、血清中IFN-γ水平;二免二周时，检测脾淋巴细胞增殖活性和淋巴细胞中Th1和Th2类细胞因子分泌。结果:GSLS-TS能快速促进疫苗诱导的机体早期免疫反应（NK细胞杀伤活性、血清IFN-γ产生），显著增强脾脏淋巴细胞增殖活性，提高淋巴细胞分泌Th1（IFN-γ、IL-12）和Th2(IL-5、IL-10)类细胞因子水平。
　　6.GSLS-TS免疫增强作用机制研究
　　目的:初步探讨GSLS-TS免疫增强作用的机制。方法:将GSLS和（或）TS与小鼠巨噬细胞系RAW264.7共孵育，以miR-132、miR-146a、miR-147和miR-155的mRNA表达为指标，分析GSLS或（和）TS对RAW264.7细胞中这4种miRs水平的影响;给ICR和C3H/HeJ小鼠免疫aPrV疫苗，以血清特异性抗体、淋巴细胞增殖反应以及淋巴细胞表达Th1和Th2类细胞因子mRNA的水平为指标，初步分析GSLS-TS免疫增强作用与TLR4的关系。结果:用GSLS或（和）TS与RAW264.7细胞共同培养时能显著提高细胞中miR-132、miR-146a、miR-147和miR-155的mRNA表达，而且GSLS和TS表现出协同作用;GSLS-TS能同时提高ICR小鼠和C3H/HeJ小鼠免疫aPrV疫苗后血清特异性抗体反应，同时增强Con A和PrV抗原诱导的淋巴细胞增殖活性以及淋巴细胞表达Th1(IFN-γ、IL-12)和Th2(IL-5、IL-10)类细胞因子的mRNA水平，说明GSLS-TS的免疫增强作用不主要与TLR4相关。
　　综上所述，GSLS和TS对aPrV疫苗诱导的抗体反应具有协同增强作用，GSLS-TS可显著增强aPrV免疫小鼠早期免疫反应、体液免疫反应、细胞免疫反应以及对野毒攻毒的抵抗力。本动物试验表明，稀释剂能显著增强猪对Pr和CSF弱毒疫苗诱导的抗体反应，显示出较好的临床应用潜力。GSLS-TS的免疫增强作用并不直接通过TLR4所介导，可能与免疫细胞中miR-132、miR-146a、miR-147和miR-155的表达上调相关，关于稀释剂的具体作用机制有待深入研究。

目录

论文说明

声明

摘要

图目录

表目录

英文缩写注释

前言

第一部分 文献综述

第一章 猪弱毒疫苗及其佐剂

1．弱毒疫苗

2．疫苗佐剂

本章小结

第二章 人参茎叶皂苷

1．人参和人参皂苷

2．人参茎叶皂苷的化学组成

3．人参茎叶皂苷的免疫增强作用

本章小结

本研究的目的和意义

第二部分 试验研究

第三章 aPrV疫苗佐剂配方的研究

1 材料与方法

2 结果与分析

本章小结

第四章 灭菌方法和贮存条件对GSLS-TS佐剂作用的影响

引言

1 材料与方法

2 结果与分析

本章小结

第五章 GSLS-TS溶液和6种商品稀释剂佐剂作用的比较

引言

1 材料与方法

2 结果与分析

本章小结

第六章 GSLS-TS提高猪对aPrV疫苗和猪瘟弱毒疫苗的抗体反应研究

引言

1 材料与方法

2 结果与分析

3 本章小结

第七章 GSLS-TS对细胞免疫的影响

引言

1 材料与方法

2 结果与分析

本章小结

第八章 GSLS-TS佐剂作用机制研究

引言

1 材料与方法

2 结果与分析

本章小结

第九章 综合讨论

1．aPrV疫苗佐剂配方的研究

2．灭菌方法和贮存条件对GSLS-TS佐剂作用的影响

4．GSLS-TS提高猪对PrV和CSF弱毒疫苗的抗体反应

6．GSLS-TS佐剂作用机制研究

结论

创新点

展望

致谢

攻读博士学位期间的主要成果

参考文献