锌指结构的完整性对三氧化二砷诱导PML蛋白降解的影响作用研究

摘要

目的:
　　(1)研究PML蛋白Ring和B-box(1&2)结构域中锌指结构对三氧化二砷（As2O3，其水溶形式为亚砷酸iAsⅢ，下文简称其为砷剂）诱导PML蛋白降解的作用机制，通过螯合其锌离子或破坏不同结构域中的锌指结构，确证锌指结构的完整性对砷剂降解PML蛋白的必要性。(2)通过研究PML蛋白的突变体，观察PML核体形成及SUMO化的招募情况，揭示PML突变体影响PML-NBs核小体形成和SUMO的机制，进而阐明砷剂无法降解突变体PML的分子机理。
　　方法:
　　本课题研究内容主要由以下三大部分构成:第一部分，利用金属螯合剂1，10-邻菲罗啉（1，10-Phenanthroline monohydrate）螯合以去除PML蛋白Ring和B-box(1&2)结构域中锌指结构的锌离子，经砷剂处理后，Western Blot检测砷剂是否依然可以诱导PML蛋白由核质转移至核基质（即由RIPA裂解液的可溶部分转变至不可溶部分），并用免疫荧光法观察PML NBs形成情况，从而确定锌指结构对于砷剂诱导PML蛋白降解的重要作用。第二部分，分别对PMLⅤ蛋白Ring，B-box1，B-box2结构域中锌指结构中的部分半胱氨酸残基或组氨酸残基进行点突变，砷剂处理后Western Blot检测PMLⅤ及其突变体蛋白溶性转变情况，进而推测各个结构域内锌指结构的破坏及重组情况。第三部分，载体细胞293T中瞬转PMLⅤ蛋白突变体，并予以砷剂处理后，免疫荧光法检测核体的形成及相关蛋白SUMO-1的招募情况，进一步阐明保持锌指结构的完整性对于砷剂降解PML蛋白的重要作用。
　　结果:
　　第一部分，(1)由免疫荧光共聚焦显微镜可观察到在金属螯合剂1，10-邻菲罗啉（1，10-Phenanthroline monohydrate）预处理后，人急性早幼粒细胞白血病细胞NB4在接受砷剂暴露后无法形成核体，且无法招募SUMO-1蛋白;(2)同样用锌螯合剂预处理PML-Ⅳ和PML-Ⅴ过表达的293T细胞或HeLa细胞，发现砷剂砷诱导PML蛋白的溶性改变被抑制，表明PML蛋白的锌离子或锌指结构完整性是砷剂降解PML蛋白的基本条件。第二部分，在第一部分实验基础上，我们在第二部分工作中构建了数十例PMLⅤ突变体，即破坏Ring和B-box(1&2)中的原有的锌指结构，Western Blot实验结果提示，破坏锌指结构的可导致砷剂无法诱导PML蛋白的溶性改变和降解，证明了锌离子或锌指结构对砷剂降解PML的重要性。第三部分，由第三部分实验结果发现，PMLⅤ蛋白突变体可导致砷剂诱导PML蛋白本身SUMO-1修饰延迟。
　　结论:
　　(1)锌指结构的完整性对于三氧化二砷降解PML蛋白起到至关重要的作用，原因为其完整性直接影响到PML溶性转变以及核体的形成。此外，在原有的锌指结构被破坏的基础上，我们还发现有些半胱氨酸和组氨酸残基可重新形成新的锌指结构，以维持其结构功能，进而PML蛋白被砷剂降解。(2)通过构建多种PML蛋白突变体，研究砷剂诱导PML蛋白招募SUMO-1修饰，发现PML蛋白的任意突变体都可导致PML蛋白SUMO-1化的延迟，首次证明，突变型PML蛋白可影响砷剂招募SUMO-1的功能。

目录

声明

致谢

摘要

英文词名

1 绪论

1．1 引言

1．2 三氧化二砷治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)研究进展

1．2．1 急性早幼粒细胞白血病(APL)

1．2．2 三氧化二砷对APL疾病的治疗作用

1．2．3 三氧化二砷治疗APL研究现状

2 锌指结构对三氧化二砷诱导PML蛋白降解的影响

2．1 实验材料与仪器

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 细胞的培养

2．2．2 Western Blot(蛋白免疫印迹法)检测相关蛋白表达

2．2．3 激光共聚焦显微镜检测相关蛋白定位

2．2．4 质粒小抽

2．2．5 贴壁细胞脂质体转染

2．2．6 点突变质粒构建

2．2．7 数据统计

2．3 实验结果

2．3．1 三氧化二砷诱导PML蛋白降解作用研究

2．3．2 金属螯合剂作用下检测锌离子对三氧化二砷诱导PML蛋白降解的影响

2．4 实验小结

3．1 实验材料与仪器

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验仪器

3．2 实验方法

3．3 实验结果

3．3．1 Ring结构域

3．1．2 B-box 1结构域

3．1．3 B-box 2结构域

3．1．4 Ring和B-box结杓域外的半胱氨酸残基

3．4 实验小结

4 PMLV蛋白突变体经三氧化二砷暴露后核体形成情况

4．1 实验材料与仪器

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验仪器

4．2 实验方法

4．3 实验结果

4．4 实验小结

5 结论

5．1 讨论

5．2 总结

5．3 论文创新点

参考文献

作者简历