白细胞介素-17A及骨桥蛋白在肺结核治疗过程中免疫调节机制研究

摘要

研究背景与实验目的:
　　结核病(Tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，M.TB)感染引起的传染性疾病，TB的发生和发展与患者的免疫功能，尤其是细胞免疫功能密切相关，其中主要效应细胞为T淋巴细胞。CD4幼稚细胞可分化为Th1、Th2和Th17亚群，IL-17为Th17细胞分泌的主要的细胞因子。有研究发现，在结核性胸水，肺结核支气管灌洗液和外周血中可检测到IL-17 mRNA的表达，提示Th17细胞及IL-17参与了结核的病理过程。而在许多功能上，Th17细胞同调节性T淋巴细胞(Regulatory T cell，Treg)密切相关，控制着体内自身免疫反应，在免疫耐受和动态平衡中起中心作用。Treg细胞数量和功能出现受损，免疫耐受就被打破。在许多慢性炎症，包括结核感染引起的慢性炎症中，IL-17和IFN-γ相互作用可以引起病理性损伤。
　　骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)属于细胞外基质蛋白，是可溶性的磷酸化糖蛋白。有研究发现，OPN可以作为细胞因子的一种参与类风湿性关节炎、肝炎、肝癌等多种疾病的发生发展。另外，OPN可通过增加IL-12和IFN-γ分泌而加重结核杆菌感染后肺部的病理性损伤。体外培养巨噬细胞株，感染结核杆菌之后，OPN在培养上清中的水平大幅度增加。这些表明OPN可能参与了TB的发生发展过程。
　　Th17细胞、Treg细胞、Th17和Treg细胞相关的细胞因子以及OPN对于结核感染的发生、发展及预后都有重要意义，但目前关于疗效和预后的动态观察报道较少，而且Th17细胞、IL-17、Treg细胞在肺结核发病过程中的作用尚存在争议。本课题将通过观察和分析初治痰涂片抗酸染色(Acid Fast Bacilli-smear, AFB)阳性的肺结核患者和经抗结核治疗AFB转阴后外周血IL-17、IL-23、IL-6、IFN-γ、IL-10、OPN、IP-10的水平，以及Treg细胞在治疗过程中的动态变化，进一步阐明肺结核治疗过程中细胞免疫的特征的变化，并探索其中的机制，同时找出评价肺结核治疗效果的可靠指标。
　　研究方法:
　　收集、整理和分析20例AFB阳性的肺结核患者的临床资料和样本，以及对应的20例健康者的资料和样本。流式细胞技术检测20例AFB阳性肺结核患者外周血单个核细胞(PBMCs)中T淋巴细胞、Treg细胞的比例，以及产生IL-17A细胞的类型和比例，酶联免疫斑点实验(Enzyme-linked Immunospot Assay，ELISPOT)检测产生IL-17A的细胞数量，酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA)检测20例AFB阳性肺结核患者治疗前后体内细胞因子IL-17A、IL-23、IL-6、IFN-γ、 IL-10，以及OPN、IP-10的水平。同样的方法检测对应的20例健康者相应指标的水平。
　　体外培养肺泡上皮细胞株(A549)，加入BCG、IL-17A、IL-10、OPN等刺激，观察细胞株的变化，ELISA法检测培养上清中细胞和因子乳酸脱氢酶(LactateDehydrogenase，LDH)的水平，研究IL-17A、IL-10、OPN等在结核的发生发展过程中的不同作用，并探索其中可能的机制。
　　体外培养健康者和肺结核患者PBMC，在BCG和OPN等刺激后24h，ELISA方法检测培养上清中细胞因子的水平。
　　研究结果:
　　第一部分:
　　AFB阳性患者表达IL-17A的能力较健康对照组明显增加，而经抗结核治疗，痰涂片转阴后，患者IL-17A的水平虽明显下降，但是仍然高于健康对照的水平。同时与健康对照组比较，AFB阳性患者表达IL-23、IL-6、IFN-γ的能力亦显著增加。流式细胞技术分析，在AFB阳性的患者中产生IL-17A细胞类型除了经典T细胞(CD3+CD56-)外，CD3+CD56+ NKT like细胞是另一个主要来源。Treg细胞以及其分泌的细胞因子IL-10能够抑制Th17细胞分泌IL-17A。IL-17A与血液中C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)和红细胞沉降率(Erythrocyte SedimentationRate，ESR)呈正相关，而与IL-10呈负相关。体外实验发现IL-17A能够诱导肺泡上皮细胞株的凋亡增加，而且能够加重BCG引起的肺泡上皮细胞损伤，而IL-10能够抑制IL-17A对肺泡上皮细胞的损伤作用。
　　第二部分:
　　OPN血浆中的水平在AFB阳性的患者中较健康对照组明显的升高，AFB转阴后又明显的下降，AFB阳性合并结核性胸水(TPE)患者OPN的表达水平明显高于AFB阳性未合并TPE的患者的水平。并且OPN与CRP呈明显正相关。OPN能够促进γ干扰素诱导蛋白10(IFN-γ-induced protein10，IP-10)的表达，IP-10在痰涂片阳性的患者中表达也明显的升高。OPN和IP-10只有在痰涂片转阴后才有明显的下降。同时，BCG能够促进肺泡上皮细胞分泌OPN，而OPN能够促进肺泡上皮细胞分泌IP-10，同样的OPN能够促进健康者和肺结核患者PBMC产生IP-10、IL-12、IFN-γ，而加入IFN-γ中和抗体后，PBMC分泌IP-10和IL-12的能力显著降低。
　　结论:
　　在结核分枝杆菌感染过程中，IL-17A能够诱导肺损伤，CD3+CD56+ NKT like细胞为AFB阳性的肺结核患者IL-17A的重要来源。在结核的发展过程中，Treg细胞及其分泌的细胞因子IL-10可以抑制IL-17A引起的肺损伤。OPN能够诱导结核感染引起的肺损伤，OPN和IP-10可能成为判断结核治疗效果的新指标。

目录

声明

致谢

摘要

缩略语表

前言

第一部分 IL-17A和Treg细胞在AFB阳性肺结核患者治疗过程中的相互作用

1 研究背景

2 实验试剂和步骤

2．1 实验仪器及耗材

2．2 实验试剂

2．3 溶液的配置

2．4 方法及步骤

2．5 数据分析

3 研究结果

3．1 肺结核患者治疗过程中随访结果

3．2 各种细胞标记设定

3．3 痰涂片抗酸染色阳性肺结核患者治疗前CD3、CD4、CD8和NKT like细胞比例

3．4 痰涂片抗酸染色阳性的肺结核患者体内细胞因子的表达水平

3．5 痰涂片阳性的患者中分泌IL-17A和IFN-γ的细胞数目

3．6 痰涂片阳性肺结核患者分泌IL-17A的细胞比例

3．7 痰涂片阳性肺结核患者Treg细胞的比例及其分泌的细胞因子IL-10的水平

3．8 IL-17A水平与CRP和ESR相关性

3．9 经治疗痰涂片抗酸染色转阴后肺结核患者各指标的动态变化

3．10 结核发生发展过程中指标动态变化的相关机制

4 讨论

第二部分 OPN与IP-10作为AFB阳性肺结核患者治疗效果评价指标的探讨

1 研究背景

2 实验试剂和步骤

2．1 实验仪器及耗材

2．2 实验试剂

2．3 溶液的配置

2．4 方法及步骤

2．5 数据分析

3 研究结果

3．1 痰涂片阳性肺结核患者血清中OPN、IP-10、TNF-α、IL-12的水平

3．2 痰涂片阳性肺结核合并结核性胸水患者血清中OPN、IP-10、TNF-α、IL-12的水平

3．3 OPN与痰涂片阳性肺结核患者严重程度的关系

3．4 痰涂片阳性肺结核患者治疗过程中OPN、IP-10、TNF-α、IL-12和CRP的动态变化

3．5 结核发生发展过程中各指标动态变化的相关机制

4 讨论

结论与展望

参考文献

综述 IL-17和OPN在结核发病过程中的作用机制研究进展

作者简历及在读期间取得的成果