GGTA1敲除猪以及低免疫原性人多能干细胞的研究

摘要

本文主要从以下几个部分进行论述：
　　第一部分 GGTA1敲除猪的研究
　　面临器官移植供体短缺的现状，异种移植是一种可行的替代方案。大量研究证明猪是合适的异种移植供体。使用猪进行异种移植仍然需要克服许多免疫排斥障碍，包括超急性免疫排斥反应(HAR)，急性体液异种排斥反应(AHXR)，急性细胞排斥反应(ACR)，凝血功能异常，慢性排斥反应(CR)和炎症反应等。基于相关致病机理的研究，研究人员认为制备基因修饰猪是克服异种移植免疫排斥障碍的有效措施。目前功能正常的猪多能干细胞系仍然没有建立，而基于同源重组进行的基因修饰在猪体细胞中效率较低，严重制约了相关研究的进展。最近几年出现了多种高效的基因定点修饰工具，包括锌指核酶(ZFN)，转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)以及CRISPR/Cas9。这些技术被成功地应用于各种模式生物中，我们也建立了基于ZFN和TALEN的猪基因修饰系统。
　　我们首先使用ZFN制备GGTA1 KO(GTKO)猪，然后在GTKO猪细胞中使用TALEN对猪白细胞抗原(SLAs)相关基因进行修饰。GGTA1参与形成的Gal是引起HAR的主要异种抗原。在进化过程中，GGTA1在人类和旧世界猴中失去功能，导致他们的细胞表面没有Gal抗原，所以他们血液中存在大量靶向Gal抗原的天然抗体。为了克服HAR障碍，研究人员在猪体细胞上通过同源重组修饰GGTA1并结合体细胞核移植技术制备GTKO猪，通过异种移植实验表明GTKO猪可以显著抑制HAR的发生。但是这种技术不仅效率很低，而且会引入外源的抗药基因，无法满足后续大量基因修饰的需求。我们将靶向GGTA1编码区序列的ZFN质粒和抗药质粒通过瞬转手段导入胎猪成纤维细胞中，经过药物筛选获得了18个单拷贝敲除和4个双拷贝敲除的细胞克隆，效率分别为23.4％和5.2％。随后我们将获得的双拷贝敲除的细胞作为核供体进行体细胞核移植，产生克隆猪。经鉴定，一共获得3头GTKO猪。同时我们利用克隆胎儿建立了一个GTKO胎猪成纤维细胞系。通过细胞表面标记鉴定证明GTKO猪的细胞膜上Gal抗原被完全清除。通过杀伤实验证明GTKO猪的细胞可以在与人血清共培养时不受抗体补体介导的免疫攻击。在GTKO猪的基础上，我们通过TALEN技术修饰猪的SLAs，将其中的部分基因替换为人类白细胞抗原(HLAs)中的部分基因。我们设计并验证了靶向SLA-1和-2的TALEN。同时我们设计并构建了相关的Ⅺ载体进行基因替换实验。通过PCR验证HLA-A基因成功替代SLA-1，并能在猪细胞中表达。这一策略在异种移植中的效果仍需要使用实验猪进行进一步的异种移植验证。
　　第二部分 低免疫原性人多能干细胞的研究
　　人多能干细胞(hPSCs)具有自我更新能力，并可以在一定条件下分化为机体内所有的细胞类型。所以研究人员尝试将hPSCs分化为各种组织细胞，用于移植替换病人身上受损的组织细胞。在人类同种异体组织器官移植的过程中，供受体细胞表面的HLAs不兼容会导致免疫排斥反应。HLAs分为HLAⅠ和HLAⅡ: CD8+T细胞识别HLAⅠ，参与直接靶细胞杀伤作用;CD4+T细胞识别HLAⅡ，分泌大量细胞因子参与调控免疫反应。我们实验室的工作重点在于使用定点基因修饰的方法降低hPSCs的免疫原性，以满足其临床使用的要求。我们实验室之前通过对B2M的KO已经建立了HLAⅠ缺陷的hPSCs，证明了其免疫原性的降低，同时hPSCs的多能性和自我更新能力都没有显著的变化。
　　在本研究中我们使用TALEN对HLAⅡ的关键调控基因CIITA进行KO，从而降低hPSCs及其分化获得的细胞中的HLAⅡ相关基因的表达。CIITA-/-hPSCs在自我更新和分化能力方面与WT hPSCs无明显差异。将CIITA-/-hPSCs分化为树突状细胞(DCs)后，CD83和CD86等表面蛋白标记物正常表达，但其结构型HLAⅡ表达显著下降。将CIITA-/-hPSCs分化为成纤维细胞后，在IFN-γ的刺激下诱导型HLAⅡ表达显著下降。将分化获得的CIITA-/-成纤维细胞与CD4+T细胞共培养，CD4+T的活化减弱。这些结果说明CIITA-/-hPSCs分化获得的组织细胞可能降低CD4+T细胞介导的免疫排斥反应。我们的研究将有利于推动hPSCs的临床应用，尤其是将hPSCs分化为结构型高表达HLAⅡ的组织细胞进行移植替换，比如DCs和T细胞等。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词

第1部分 文献综述

第1章 基因修饰猪用于异种移植的研究进展

1．1 猪异种移植免疫障碍

1．2 促进异种移植发展的相关技术

1．3 组织器官异种移植的研究进展

1．4 展望

第2章 人多能干细胞移植的免疫障碍

2．1 人多能干细胞移植的意义

2．2 人多能干细胞的免疫原性

2．3 克服人多能干细胞移植免疫障碍的相关策略

2．4 展望

第2部分 实验研究

第3章 GGTA1敲除猪的研究

3．1 引言

3．2 材料和方法

3．3 实验结果和讨论

3．4 结论

第4章 低免疫原性人多能干细胞的研究

4．1 引言

4．2 材料和方法(与3．2相同者，省略)

4．3 实验结果和讨论

4．4 结论

第5章 过表达转录因子提高人多能干细胞造血分化能力

5．1 引言

5．2 材料和方法(与3．2，4．2相同者，省略)

5．3 实验结果和讨论

5．4 结论

第6章 全文总结和展望

参考文献

作者简历

在学期间所取得的科研成果