染料木黄酮通过Akt/NF-κB通路增敏吉西他滨抑制骨肉瘤增殖和诱导凋亡的研究

摘要

骨肉瘤(osteosarcoma)是儿童和青少年最常见的起源于间充质细胞的恶性骨肿瘤，目前采用新辅助化疗、保肢手术等综合治疗方案后，疗效有了显著提高，5年生存率达到65％～75％，但复发或转移的骨肉瘤患者5年生存率仍低于20％;对于复发性或转移性骨肉瘤的治疗，目前匮乏有效手段，预后极差，骨肉瘤化疗过程中肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性，抑制凋亡，导致恶性增殖，是其治疗失败的重要原因。因此，寻找有效的耐药逆转剂或化疗增敏剂是目前亟需解决的关键问题。
　　吉西他滨(Gemcitabine)是一种嘧啶核苷类似物，属于抗代谢类抗癌药，已应用于骨肉瘤的实验及临床研究。它主要作用于DNA合成期和G1后期，可阻止细胞由G1期进入S期，从而使细胞停滞于G1/S期。吉西他滨在细胞内经核苷激酶作用转化成具有活性的代谢产物。并且，吉西他滨本身还可增强核苷激酶活性，起到自我增效的作用。研究报道，吉西他滨的单药化疗，疗效不尽人意，可能与吉西他滨激活NF-κB通路，促进肿瘤增殖和抑制凋亡，导致肿瘤耐药相关。因此，抑制肿瘤的增殖和诱导凋亡，探讨利用非细胞毒药物来增敏化疗药物疗效，给骨肉瘤的治疗带来新的曙光。
　　黄酮类化合物(Flavonoid compounds)是一类多酚化合物，具有一个共同的碳架结构(C6-C3-C6)，其中心结构是2-苯基-1，4-苯并吡喃酮，能够降低肿瘤的发病率，更为重要的是其可以诱导肿瘤的凋亡。研究表明，染料木黄酮(Genistein)具有良好的抗肿瘤作用，能够抑制Akt/NF-κB通路，通过抑制肿瘤增殖和诱导凋亡来增敏化疗药物疗效。
　　Akt/NF-κB通路介导的肿瘤耐药机制是多方面的，抑制凋亡可能是其重要因素，其可能机制如下:1）NF-κB细胞核内的转录活性增强;2）诱导抗凋亡基因Bcl-XL、Bcl-2的表达，抑制肿瘤细胞凋亡;3）促进凋亡蛋白因子Survivin的表达，直接抑制效应分子caspase-7、caspase-3特异性结合，从而抑制凋亡的发生;4）促进环氧化酶-2(cyclooxygenase，COX)的表达，介导肿瘤增殖和凋亡抑制。综上，Akt/NF-κB通路主要通过抑制肿瘤细胞凋亡导致肿瘤耐药的产生。因此，Akt/NF-κB通路很可能是肿瘤治疗中的有效靶点。
　　鉴于吉西他滨在骨肉瘤治疗中的耐药及染料木黄酮的药物增敏作用，我们设计了药物联合作用的课题，本课题将主要通过以下两方面内容来研究:第一部分，以骨肉瘤细胞系为研究对象，阐明染料木黄酮增敏吉西他滨抑制骨肉瘤增殖和诱导凋亡的作用及机制。第二部分，建立经原位种植的骨肉瘤细胞小鼠模型，以病理组织学方法结合细胞免疫化学染色法研究染料木黄酮和/或吉西他滨作用后，对肿瘤生长的抑制作用，并检测信号通路，验证体外实验结果。
　　第一部分:染料木黄酮增敏吉西他滨抑制骨肉瘤增殖和诱导凋亡的体外研究
　　目的:研究染料木黄酮增敏吉西他滨抑制骨肉瘤增殖和诱导凋亡的作用及机制。
　　方法:实验分为对照组、染料木黄酮(20μmol/L)组、吉西他滨(0.5μmol/L)组、药物联合4组。通过细胞增殖抑制实验(MTT)测定对骨肉瘤细胞系的增殖抑制效果;应用电镜来观察药物作用后骨肉瘤细胞的形态学变化;通过DNA Ladder和TUNEL检测凋亡现象;流式细胞仪分析凋亡变化;通过RT-PCR、Western blot及免疫共沉淀检测相关蛋白变化。
　　结果:药物联合组可显著抑制MG-63、U2OS、MNNG/HOS细胞增殖，可见特征性的DNA ladder条带，且凋亡率明显增高。吉西他滨可诱导各细胞系NF-κB激活，促进骨肉瘤增殖和抑制凋亡。而药物联合组明显降低p-Akt、NF-κB、bcl-2、Bcl-xL、COX-2、survivin等的表达。
　　结论:染料木黄酮可通过Akt/NF-κB通路增敏吉西他滨抑制骨肉瘤细胞的增殖和诱导凋亡。
　　第二部分:染料木黄酮增敏吉西他滨抑制骨肉瘤小鼠肿瘤增殖和诱导凋亡的体内研究
　　目的:研究染料木黄酮增敏吉西他滨抑制骨肉瘤小鼠肿瘤增殖的作用及机制。
　　方法:骨肉瘤细胞MNNG/HOS注射于BALB/c小鼠皮下，建立原位骨肉瘤细胞小鼠模型。在骨肉瘤细胞种植后5天，将小鼠随机分为4组，每组6只。第一组为对照组;第二组为吉西他滨组，吉西他滨80mg/kg隔天腹腔内注射;第三组为染料木黄酮组，以染料木黄酮1 mg/天给予每只小鼠灌胃，连续口服10天;第四组为药物联合组，即言西他滨与染料木黄酮共同作用。所有小鼠在药物处理后3天后处死，取肿瘤组织并称重。采用肿瘤体积重量观察、解剖观察及组织学染色检查原发病灶。以病理组织学HE染色方法检测骨肉瘤凋亡现象;原位TUNEL检测骨肉瘤凋亡;结合细胞免疫化学染色法检测NF-κB及Bcl-xL表达变化;并通过肿瘤组织Western blot和免疫共沉淀检测p-Akt、NF-κB表达，即验证体外的抗肿瘤途径。
　　结果:药物联合能够明显降低肿瘤的体积和重量，诱导肿瘤凋亡，NF-κB及Bcl-xL表达明显下降(p＜0.0001)。吉西他滨可诱导NF-κB激活;而与染料木黄酮联合可明显抑制NF-κB表达，并且p-Akt表达显著降低。
　　结论:在荷瘤小鼠体内，染料木黄酮通过Akt/NF-κB途径增敏吉西他滨抑制骨肉瘤细胞的增殖和诱导凋亡。

目录

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致谢

摘要

缩略语

1 绪论

1．1 骨肉瘤的治疗进展

1．2 吉西他滨

1．3 染料木黄酮

1．4 细胞凋亡

1．5 Akt／NF-κB通路

第一部分 染料木黄酮增敏吉西他滨抑制骨肉瘤增殖和诱导凋亡的体外研究

1 引言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论与小结

第二部分 染料木黄酮或／和吉西他滨体内抑制骨肉瘤增殖研究

1 引言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论与小结

结论

参考文献

综述 黄酮类化合物诱导肿瘤凋亡的关键分子机制研究

作者简介及研究生期间科研情况