气味结合蛋白生物传感器研究

摘要

生物的嗅觉系统能够灵敏、特异地检测和识别复杂环境中痕量的气味分子，是一种性能优越的化学感受和检测系统。在生物嗅觉的启发下，研究者们一直致力于在体外模仿生物体的嗅觉感知能力，以期实现构建高灵敏、高特异性的嗅觉生物传感器，拓展其在环境监测、食品检测，及疾病诊断等领域的应用及发展。但是，目前常用的生物敏感材料（嗅觉组织、嗅觉细胞及嗅觉受体）存在着获取困难、活性较难保持等问题，限制了嗅觉传感器的进一步发展。气味结合蛋白（odorant-binding proteins，OBPs）作为一种胞外嗅觉蛋白，具有良好的气味分子结合能力，同时其稳定性较好，且易于实现体外表达和纯化。因此，气味结合蛋白传感器对于嗅觉生物传感的研究具有重要的现实意义和应用前景。
　　本论文以中华蜜蜂气味结合蛋白(ASP2)、桔小实蝇气味结合蛋白（BdorOBP2），及人气味结合蛋白(OBP2a和OBP2b)为研究实例，结合不同的电化学检测技术及生物敏感元件固定方法，完成了多种气味结合蛋白传感器的设计和构建，实现了对化学信息素等气味分子的检测。结合电化学阻抗模型和分子对接技术，探讨了气味结合蛋白与气味分子之间的相互作用，分析了气味结合蛋白传感器的应用及发展。论文的主要内容及创新点如下:
　　1.设计并构建了昆虫气味结合蛋白传感器，实现了对化学信息素的检测。
　　昆虫具有非常灵敏的嗅觉系统，这与其气味结合蛋白结合气味分子的能力密切相关。本论文以中华蜜蜂气味结合蛋白(ASP2)和桔小实蝇气味结合蛋白(BdorOBP2)为研究实例，设计并构建了昆虫气味结合蛋白传感器。首先成功表达和纯化了这两种气味结合蛋白，然后利用物理吸附和层层自组装的方法将其固定于叉指电极表面。通过电化学阻抗技术，该传感器实现了对不同化学信息素的检测，而且相较于其他类型气味结合蛋白传感器，其具有较宽的检测范围、较好的检测灵敏度和检测下限。
　　2.基于气味结合蛋白三维结构，设计了电化学阻抗模型，结合分子对接技术分析了气味结合蛋白与化学信息素的相互作用。
　　基于气味结合蛋白结合气味分子的主要场所是其结构中心的疏水腔体，并且结合和释放气味分子的过程是需要蛋白构象的改变来实现的这一机理，本论文构建了昆虫气味结合蛋白检测化学信息素的电化学阻抗模型，包括蛋白骨架和中心疏水腔两部分，进而对气味结合蛋白构象改变与传感器阻抗变化之间的关系进行了分析。同时结合分子对接的结果，分析了气味结合蛋白的三级结构中关键氨基酸残基在结合化学信息素过程中所发挥的作用，这为研究气味结合蛋白的特异性传感结合能力奠定了基础。
　　3.设计并构建了人气味结合蛋白传感器，实现了对不同链长脂肪酸分子的检测。
　　脂肪酸是生物体的重要组成和储能物质，也是一种重要的亲脂性物质。本论文利用人气味结合蛋白对脂肪酸具有较好亲和力的这一特性，设计了一种用于脂肪酸分子检测的人气味结合蛋白OBP2a传感器。利用电化学还原的方法将氧化石墨烯还原为还原型氧化石墨烯并将其固定于印刷电极的碳工作电极表面，在增加电极导电性的同时，利用残留的含氧官能团将气味结合蛋白固定于传感器表面。利用循环伏安检测技术，该传感器实现了对二十二碳六烯酸、亚油酸，及月桂酸的测量。检测结果表明人气味结合蛋白对中、长链脂肪酸具有较好的结合能力，可用于分析不同碳链长的脂肪酸物质。
　　4.利用阳极氧化铝纳米孔阵列，设计并构建了气味结合蛋白传感器，实现了对苯甲醛、脂肪酸等分子的检测。
　　阳极氧化铝纳米孔阵列是一种具有纳米尺寸孔道的滤膜材料，其具有比表面积大的特点，已经广泛应用于溶液中目标物质的高灵敏检测。本论文基于人气味结合蛋白OBP2b对苯甲醛等气味分子的结合能力，利用三电极体系，构建了基于阳极氧化铝纳米孔阵列的生物传感器。将修饰有气味结合蛋白的阳极氧化铝纳米孔阵列置于工作电极与参比/对电极之间，使得纳米孔阵列成为电化学检测体系中电流及溶液流通的唯一通路。在苯甲醛及脂肪酸的作用下，固定于纳米孔阵列上的气味结合蛋白构象发生改变，进而引起纳米孔中电流的变化。通过电化学阻抗检测，实现了对不同浓度苯甲醛及脂肪酸的检测。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 绪论

1．1 气味结合蛋白概述

1．2 嗅觉生物传感器的研究

1．2．1 基于嗅觉组织的生物传感器

1．2．2 基于嗅觉细胞的生物传感器

1．2．3 基于嗅觉受体蛋白的生物传感器

1．3 基于气味结合蛋白的生物传感器

1．3．1 表面等离子体共振传感器

1．3．2 压电传感器

1．3．3 场效应晶体管传感器

1．3．4 电化学生物传感器

1．4 本论文主要研究内容

参考文献

第二章 气味结合蛋白的生物传感特性

2．1 气味结合蛋白的生理功能

2．2 气味结合蛋白的结构及特性

2．2．1 昆虫气味结合蛋白的结构及特性

2．2．2 脊椎动物气味结合蛋白的结构及特性

2．3 气味结合蛋白与气味分子的结合特性研究

2．3．1 同源建模在气味结合蛋白结构研究中的应用

2．3．2 分子对接在生物分子结合力分析中的应用

2．3．3 气味结合蛋白与配体分子的结合特性分析

2．4 本章小结

参考文献

第三章 电化学分析技术及传感器构建

3．1 电化学分析技术

3．1．1 电化学阻抗检测技术

3．1．2 循环伏安检测技术

3．2 电化学检测电极系统

3．2．1 三电极检测系统

3．2．2 叉指电极检测系统

3．2．3 印刷电极检测系统

3．3 生物敏感材料的固定化技术

3．3．1 物理吸附法

3．3．2 共价交联法

3．3．3 层层自组装法

3．4 本章小结

参考文献

第四章 昆虫气味结合蛋白传感器对化学信息素的检测研究

4．1 化学信息素的检测及应用研究

4．2 昆虫气味结合蛋白传感器的构建

4．2．1 气味结合蛋白的表达与纯化

4．2．2 气味结合蛋白传感器的构建

4．2．3 气味结合蛋白传感器的表征

4．3 化学信息素的电化学阻抗检测

4．3．1 中华蜜蜂气味结合蛋白传感器对化学信息素的检测

4．3．2 桔小实蝇气味结合蛋白传感器对化学信息素的检测

4．3．3 气味结合蛋白与化学信息素的相互作用分析

4．4 本章小结

参考文献

第五章 人气味结合蛋白传感器对脂肪酸分子的检测研究

5．1 脂肪酸分子的检测及应用研究

5．2 基于印刷电极的气味结合蛋白传感器构建

5．2．1 电化学还原氧化石墨烯修饰印刷电极

5．2．2 气味结合蛋白修饰印刷电极

5．2．3 电化学循环伏安扫描研究

5．3 气味结合蛋白生物传感器对脂肪酸分子的检测

5．3．1 亚油酸的循环伏安检测

5．3．2 不同链长脂肪酸的循环伏安检测及分析

5．3．3 脂肪酸分子的特异性检测

5．4 本章小结

参考文献

第六章 基于纳米孔阵列的气味结合蛋白传感器研究

6．1 纳米孔器件在生物传感检测中的应用

6．2 纳米孔阵列气味结合蛋白传感器的构建

6．2．1 气味结合蛋白修饰纳米孔阵列

6．2．2 气味结合蛋白固定的电化学表征

6．2．3 纳米孔材料的电化学特性分析

6．3 气味结合蛋白配体分子的电化学检测

6．3．1 苯甲醛的电化学检测

6．3．2 脂肪酸分子的电化学检测

6．3．3 气味结合蛋白的特异性及结合能力分析

6．4 本章小结

参考文献

第七章 总结与展望

7．1 本文研究总结

7．2 问题及展望

参考文献

作者简历

攻读学位期间发表的学术论文及成果