中华鳖肠道粘膜免疫细胞分子机理及口服纳米疫苗的研究

摘要

中华鳖（Pelodiscus sinensis），俗称甲鱼，是中国传统的淡水养殖品种。近几年来，由于养殖密度增加、养殖环境日益恶劣，中华鳖在养殖过程中遭受了各类病原微生物的侵害。这些病原微生物往往能引起养殖物种的大量死亡，给养殖户造成巨大的经济损失，威胁水产养殖业的可持续发展。目前主要采用化学药物防治疾病，而化学药物的不规范使用会带来较大的食品安全隐患，并危害生态环境。免疫防治作为一种更加安全环保的防控手段，开始逐渐成为研究热点。肠道是动物重要的免疫器官，是机体抵抗外源微生物的第一道防线。研究中华鳖的肠道粘膜免疫系统，有助于更好地了解中华鳖的免疫防御机制，并为制作口服纳米疫苗提供理论基础。研究中采用组织学、分子生物学以及转录组学的方法系统研究了中华鳖肠道粘膜免疫系统，确定了肠道主要的免疫细胞，揭示了肠道对外源刺激物产生免疫应答的的分子机制，分析了参与粘膜免疫的重要蛋白多聚免疫球蛋白受体的免疫应答反应，并在以上免疫机理的基础上，研制了一种运载病原菌外膜蛋白的纳米口服疫苗，并检测了其对中华鳖的免疫应答反应。具体研究结果如下:
　　1.中华鳖肠道粘膜免疫相关细胞的形态学观察和研究
　　利用透射电子显微镜观察了中华鳖肠道横切面，发现肠道存在着大量的上皮内淋巴细胞和杯状细胞。将外源温和气单胞菌和LPS诱导中华鳖，利用HE染色和PAS染色方法分别观察和统计肠道绒毛上皮内淋巴细胞和杯状细胞的数目变化，结果发现该两种免疫细胞数目在肠道前段、中段和后段，均表现为先上升后下降的趋势，且在48h数目达到最大值，显著高于生理盐水对照组(P＜0.05)。同时还利用荧光定量PCR技术来检测外源诱导物LPS和温和气单胞菌对肠道免疫球蛋白IgM和IgD的基因表达的影响，结果发现IgM基因表达量上升，而IgD基因的表达量变化不明显。
　　2.转录组学方法研究中华鳖肠道粘膜免疫机制
　　利用组织切片及转录组学技术深入分析外源LPS诱导中华鳖肠道的免疫应答机制。结果显示，LPS刺激48h后，肠道的免疫相关细胞杯状细胞和上皮内淋巴细胞数目显著上升，说明外源LPS引起了肠道免疫应答。利用转录组学技术，发现外源LPS诱导组和生理盐水对照组之间存在着748个差异表达基因，包括361个表达量上调的基因和387个表达量下调的基因，其中有48个基因被鉴定与免疫相关，这些基因属于82个GO terms和14个途径。
　　3.中华鳖pIgR基因的克隆及其对外源刺激的免疫应答
　　通过氨基酸结构以及同源性分析，发现中华鳖pIgR基因能够编码591个氨基酸，蛋白分子量和等电点分别为65.7kDa和7.38，包含有胞外区、跨膜区以及胞内区，其中胞外区包括了四个结构域;pIgR与其他爬行动物的同源性较高，鸟类、哺乳类和两栖类次之，而与鱼类的同源性最低。通过荧光定量PCR，显示pIgR基因在各组织器官中的表达量从高到低依次为:小肠、食道、大肠、肝脏、心脏、肌肉、脾脏、胃和肾脏;在胚胎发育过程中，该基因的表达量呈现一个先上升后下降的趋势，在孵化31d时达到最大值。受到外源刺激物温和气单胞菌和LPS诱导后，pIgR mRNA的表达量在食道、胃、小肠和大肠中均有显著上调后又逐渐恢复正常水平的变化趋势。Western blotting和免疫组化结果显示，pIgR蛋白在肠上皮细胞细胞质中表达，且小肠组织pIgR蛋白表达会随着LPS诱导上调，说明该蛋白在中华鳖粘膜免疫中具有重要作用。
　　4.中华鳖口服纳米疫苗及免疫效果的研究
　　利用离子交换法制备得到一种羧甲基壳聚糖纳米颗粒，羧甲基壳聚糖和CaCl2的最佳配比为:0.5mg/mL与2mg/mL，制备得到的纳米颗粒平均粒径为229.07±4.28nm，多分散系数PDI仅为0.070±0.02，颗粒粒径小、分散性好、颗粒均一，具有较好的安全性、稳定性以及对肠道的通透性。从嗜水气单胞菌中提取主要蛋白大小为43kDa和38kDa的外膜蛋白，利用羧甲基壳聚糖纳米粒包埋该蛋白制备得到一种纳米口服疫苗，以生理盐水、羧甲基壳聚糖纳米粒以及外膜蛋白作为对照，通过组织化学和荧光定量PCR技术来检验口服纳米疫苗的免疫效果，结果发现纳米疫苗的免疫效果高于外膜蛋白和羧甲基壳聚糖，且二次强化免疫也能引起机体肠道的免疫反应。

目录

声明

致谢

摘要

主要英文缩写及译名

第1章 绪论

1．1 肠道粘膜免疫系统的粘液层

1．1．1 先天性免疫因子

1．1．2 适应性免疫因子

1．2 肠道免疫细胞

1．2．1 髓细胞

1．2．2 淋巴细胞

1．2．3 杯状细胞

1．3 水生动物多聚免疫球蛋白受体(pIgR)的研究进展

1．3．1 pIgR的结构

1．3．2 pIgR的表达调控

1．3．3 pIgR的生物学作用

1．3．4 水产动物pIgR的研究进展

1．4 研究目的和意义

1．5 技术路线图

第2章 中华鳖肠道粘膜免疫相关细胞的形态学观察和研究

2．1 材料与仪器

2．1．1 实验仪器

2．1．2 实验试剂

2．1．3 主要试剂配置

2．2 实验方法

2．2．1 实验动物与菌株

2．2．2 超薄切片和透射电镜观察

2．2．3 灌喂脂多糖和温和气单胞菌

2．2．4 肠道组织切片和染色

2．2．5 上皮内淋巴细胞和杯状细胞计数

2．2．6 中华鳖肠道组织总RNA的提取

2．2．7 利用荧光定量PCR检测免疫相关基因的表达变化

2．2．8 数据统计分析

2．3 实验结果

2．3．1 中华鳖肠道超微结构

2．3．2 脂多糖和温和气单胞菌对中华鳖肠道上皮内淋巴细胞数目的影响

2．3．3 脂多糖和温和气单胞菌对中华鳖肠道上杯状细胞数目的影响

2．3．4 脂多糖和温和气单胞菌对中华鳖肠道免疫相关基因表达的影响

2．4 讨论

2．5 本章小结

第3章 转录组学方法研究肠道粘膜免疫机制

3．1 材料与仪器

3．1．1 实验仪器

3．1．2 实验试剂

3．1．3 主要试剂配置

3．1．4 主要数据库

3．2 实验方法

3．2．1 实验动物

3．2．2 组织学检查

3．2．3 RNA提取

3．2．4 RNA-seq测序文库制备和Illumina测序

3．2．5 RNA-seq数据分析

3．2．6 功能富集分析

3．2．7 荧光定量PCR验证差异表达基囡

3．2．8 统计学分析

3．3 实验结果

3．3．1 IELs和杯状细胞的分布和数据统计

3．3．2 转录组序列组装

3．3．3 差异基因的功能注释和分类

3．3．4 鉴定免疫相关基因

3．3．5 qRT-PCR验证RNA-seq结果

3．4 讨论

3．4．1 病原体识别

3．4．2 白细胞

3．4．3 细胞园子

4．4．4 凋亡

3．4．5 脂类／维生素的消化和吸收

3．4．6 IgA产生的免疫网络

3．5 本章小结

第4章 中华鳖pIgR基因的克隆及其对外源刺激的免疫应答

4．1 材料与仪器

4．1．1 实验试剂

4．1．2 主要试剂配制

4．2 实验方法

4．2．1 实验动物

4．2．2 pIgR生物信息学分析

4．2．3 pIgR全长的克隆、组织及胚胎表达分析

4．2．4 外源刺激物对中华鳖pIgR基因表达的影响

4．2．5 pIgR的抗原表位设计和多克隆抗体的制作

4．2．6 Western blot检测

4．2．7 免疫组化分析

4．2．8 数据统计分析

4．3 结果

4．3．1 pIgR基因序列和同源性分析

4．3．2 多序列比对和系统发育树的构建

4．3．3 pIgR的全长克隆

4．3．5 pIgR在中华鳖不同胚胎发育时期的表达

4．3．6 温和气单胞菌对消化道pIgR基因表达的影响

4．3．7 脂多糖对消化道pIgR基因表达的影响

4．3．8 脂多糖对肠道pIgR蛋白表达的影响

4．4 讨论

4．5 本章小结

第5章 中华鳖口服纳米疫苗及免疫效果的研究

5．1．1 实验试剂

5．1．2 主要试剂配制

5．1．3 实验仪器

5．2 实验方法

5．2．1 实验动物

5．2．2 病原菌外膜蛋白的提取

5．2．3 羧甲基壳聚糖纳米粒的制作和性质鉴定

5．2．4 合荧光标记的羧甲基壳聚糖纳米粒的制作和性质鉴定

5．2．5 羧甲基壳聚糖纳米颗粒疫苗的制作和口服免疫效果

5．3 实验结果

5．3．1 细菌外膜蛋白的提取

5．3．2 羧甲基壳聚糖纳米粒的制作

5．3．3 纳米颗粒的包封率检测

5．3．4 羧甲基壳聚糖纳米颗粒稳定性测定

5．3．5 组织病理学分析

5．3．6 FITC标记的羧甲基壳聚糖纳米颗粒的示踪

5．3．7 肠道上杯状细胞的数目变化

5．3．8 荧光定量检测免疫相关基因的表达

5．4 讨论

5．5 本章小结

第6章 研究结果及展望

6．1 研究结果

6．2 主要创新点

6．3 不足和展望

参考文献

作者简历及攻读博士期间发表的论文

附录