细胞选择性梯度生物材料的构建及其调控细胞迁移行为研究

摘要

细胞迁移是生理学和病理学中十分重要的过程，与胚胎发育、血管生成、免疫应答以及肿瘤转移等过程息息相关。生物体内细胞能够对生物化学或生物物理信号刺激做出响应从而进行迁移。由于非必要的或过度的细胞迁移会导致组织不正确的修复甚至导致疾病，因此选择性调控细胞迁移非常重要。模拟一些信号分子对细胞的作用可望实现选择性调控细胞迁移，为生物材料设计提供理论支持和实验依据。
　　通过聚酯胺解在表面引入氨基，再经过戊二醛偶联，接枝明胶分子。利用注射泵改变胺解时间，即可在表面构建明胶梯度。发现在明胶密度梯度的表面，内皮细胞(Endothelial cells，ECs)骨架沿梯度方向排列。内皮细胞在明胶密度梯度表面趋向于向明胶分子密度增加的方向迁移。最高有90％的内皮细胞向梯度正方向迁移，迁移速率达11μm/h。发现明胶分子密度梯度对于平滑肌细胞(Smooth muscle cells，SMCs)和成纤维细胞(Fibroblasts，FIBs)迁移的方向性影响较为显著，然而对细胞迁移速率影响并不明显。结果证实，单一明胶梯度对于不同细胞没有选择性。
　　之前关于细胞选择性的表面修饰研究都基于模型材料表面，修饰方法较为复杂。基于第二章工作，提出了一个具有普适性、更简单的表面修饰方法。在聚己内酯(Polycaprolactone，PCL)膜材料表面沉积一层聚多巴胺，使表面带有氨基。将透明质酸用甲基丙烯酸酐改性后(MA-HA)接枝在聚多巴胺表面以构建细胞阻粘层。精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-缬氨酸（Arg-Glu-Asp-Val, REDV）多肽能够特异性识别内皮细胞。REDV多肽修饰巯基后通过迈克尔加成，接枝在MA-HA表面;结合注射法，构建出REDV多肽密度梯度。在REDV多肽接枝表面，内皮细胞粘附数量可达到平滑肌细胞的2.5倍。内皮细胞在REDV多肽密度梯度表面迁移定向性达到86％，同时迁移速率增大到细胞培养板(Tissueculture polystyrenes，TCPS)表面2倍;平滑肌细胞则表现出没有定向性的迁移，迁移速率下降50％以上。细胞片迁移结果表明内皮细胞片向梯度正方向迁移距离是均匀表面的3倍。
　　成纤维细胞激活后向血管中层迁移是导致血管外膜纤维化的原因之一。因此，血管受损后选择性促进平滑肌细胞的粘附和迁移非常重要。在材料表面构建一层聚乙二醇的均匀阻粘分子层，通过共价接枝梯度固定细胞特异性多肽，能够实现细胞的选择性粘附和迁移。缬氨酸-丙氨酸-脯氨酸-甘氨酸(Val-Ala-Pro-Gly, VAPG)多肽对平滑肌细胞具有特异选择性作用。首先通过盐溶液密度梯度在表面构建了一层均匀的聚乙二醇阻粘分子层，末端带有梯度的叠氮基团，再通过点击反应，将炔基修饰的VAPG多肽接枝在表面。VAPG多肽接枝实现了对于平滑肌细胞的选择性粘附，平滑肌细胞密度最高可达成纤维细胞2倍。VAPG多肽的接枝使平滑肌细胞迁移速率提高，成纤维细胞迁移速率降低。平滑肌细胞迁移速率（22μm/h）最高达到相同位置成纤维细胞迁移速率3倍以上;84％的平滑肌细胞趋向VAPG多肽接枝密度增加的方向迁移，且平滑肌细胞有效迁移距离显著性增大。
　　三维环境下的细胞迁移与二维平面上有很大不同。因此模拟细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)构建相应材料来研究细胞迁移行为具有更重要的意义。基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)是在大部分细胞均有表达的一类能够降解细胞外基质的蛋白水解酶。在本章中，通过甲基丙烯酸酐改性的透明质酸双键和基质金属蛋白酶-2（MMP-2）敏感的多肽序列上的巯基迈克尔加成反应，构建了一种对细胞分泌的MMPs产生响应从而降解的水凝胶。通过Transwell模型，考察了平滑肌细胞在水凝胶内的三维迁移情况。平滑肌细胞在有其他细胞诱导下，向酶敏感水凝胶内部迁移达120μm。进一步研究影响其迁移行为的因素发现，平滑肌细胞在水凝胶内主要以间充质方式迁移，MMP-2降解水凝胶导致网络结构疏松是细胞在水凝胶内部迁移的主要原因。体内实验结果说明，细胞向降解程度不同的水凝胶内部侵袭方式不同，且侵袭深度随水凝胶可降解程度增加而增大。
　　在本文中，采用聚合物阻粘层结合细胞特异性多肽这一手段，构建了两种细胞选择性表面，并成功在生物降解材料聚己内酯表面实现了这一目标。多巴胺沉积进而偶联其他分子具有普适性，因而该表面修饰方法可适用于多种材料表面。进一步构建的模拟细胞外基质环境水凝胶，阐明细胞在其中的三维迁移行为，有助于发展具有特殊结构和功能的生物材料，以更好地实现组织再生。

目录

声明

致谢

摘要

1 引言

1．1 细胞迁移及其重要性

1．1．1 细胞迁移的意义

1．1．2 细胞迁移过程

1．1．3 细胞选择性的意义

1．2 体内梯度与细胞迁移

1．2．1 物理梯度

1．2．2 化学梯度

1．3 梯度材料及其制备方法

1．3．1 表面化学梯度

1．3．2 表面物理梯度

1．3．3 三维梯度

1．4 梯度材料对细胞行为的影响

1．4．1 化学梯度

1．4．2 物理梯度

1．4．3 混合梯度和三维梯度

1．5 课题提出

2 聚(ε-己内酯)表面明胶接枝密度梯度的构建及其对细胞迁移的影响

2．1．1 实验原料和试剂

2．1．2 PCL表面胺解

2．1．3 表面明胶梯度的构建

2．1．4 材料表征

2．1．5 细胞培养

2．1．6 细胞迁移表征

2．1．7 细胞与基底间相互作用

2．1．8 统计分析

2．2 PCL膜表面明胶梯度的表征

2．2．1 PCL表面胺解后氨基密度表征

2．2．2 PCL膜表面接枝明胶表征

2．3 细胞粘附表征

2．4 内皮细胞在材料表面的迁移

2．5 平滑肌细胞和成纤维细胞在材料表面迁移

2．6 本章小结

3 透明质酸修饰的PCL膜表面REDV多肽密度梯度的构建及其选择性促进内皮细胞的粘附和迁移

3．1 实验部分

3．1．1 实验原料和试剂

3．1．3 PCL表面聚多巴胺的沉积

3．1．4 MA-HA以及REDV多肽的接枝

3．1．5 材料表征

3．1．6 细胞培养

3．1．7 细胞共培养

3．1．9 细胞迁移表征

3．2 材料表征

3．2．2 MA-HA和REDV多肽接枝量

3．2．3 REDV多肽梯度表征

3．3 内皮细胞的选择性粘附

3．4 细胞-基底相互作用力

3．5 内皮细胞和平滑肌细胞形态和取向

3．6 细胞迁移表征

3．6．1 单个细胞迁移分析

3．6．2 细胞片迁移模型分析

3．7 本章小结

4 VAPG多肽密度梯度的构建及其选择性促进平滑肌细胞的粘附和迁移

4．1 实验部分

4．1．1 实验原料和试剂

4．1．3 含氨基和叠氮表面的构建

4．1．4 炔基VAPG多肽的接枝

4．1．5 材料表征

4．1．6 细胞培养

4．1．7 细胞共培养

4．1．8 细胞迁移表征

4．1．9 细胞-表面相互作用

4．1．10 平滑肌细胞迁移过程中蛋白表达量测定

4．1．11 统计分析

4．2．1 VAPG多肽接枝量

4．2．2 VAPG多肽密度梯度表征

4．3 平滑肌细胞和成纤维细胞的选择性粘附

4．4 细胞-材料表面粘附力

4．5 细胞形态和取向

4．6 细胞迁移表征

4．6．1 单细胞迁移轨迹和速率统计

4．6．2 单细胞有效迁移距离统计

4．7 平滑肌在材料表面迁移机理探究

4．8 本章小结

5 基质金属蛋白酶敏感水凝胶的构建及其对细胞在三维环境内迁移的影响

5．1 实验部分

5．1．1 实验原料和试剂

5．1．2 甲基丙烯酸酐改性透明质酸(MA-HA)的合成

5．1．3 基于MA-HA的水凝胶构建

5．1．4 水凝胶的表征

5．1．5 细胞培养

5．1．6 细胞三维迁移表征

5．1．7 细胞三维迁移分析

5．1．8 体内验证

5．2 材料表征

5．2．2 溶胀率分析

5．2．3 红外光谱表征

5．2．4 水凝胶机械性能表征

5．2．5 水凝胶降解性能表征

5．3 细胞在水凝胶内三维迁移

5．3．1 平滑肌细胞在水凝胶内部迁移

5．3．2 内皮细胞在水凝胶内部迁移

5．4 平滑肌细胞在水凝胶内部迁移机理探究

5．5 水凝胶体内包埋实验

5．6 本章小结

6 全文总结

不足与展望

参考文献

个人简介