α7烟碱样乙酰胆碱受体在肿瘤相关巨噬细胞抑制结直肠癌侵袭转移中的作用研究

摘要

结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一。结直肠癌微环境中存在大量肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages，TAMs)且其对结肠癌生长、浸润、转移具有重要的影响。目前TAMs与结直肠癌的关系尚不明确。一些临床研究报道结直肠癌中的TAMs浸润越多，肿瘤血管生成明显增加、肿瘤细胞分化更差，淋巴结转移率增高，与肿瘤预后呈负相关。也有研究发现TAMs与肿瘤的转移、肿瘤的分期和预后呈正相关。因此，TAMs与结直肠癌的关系，尤其是与肿瘤肝转移的关系有待进一步研究。α7烟碱样乙酰胆碱受体(α7nAChR)表达于多种非神经元细胞包括巨噬细胞。α7nAChR的表达失衡与肿瘤形成、进展等有关。目前TAMsα7nAChR表达情况以及α7nAChR受体活化后与结直肠癌的生物学行为的关系尚未见报道。
　　目的：
　　研究肿瘤相关巨噬细胞的α7烟碱样乙酰胆碱受体(α7nAChR)对结直肠癌侵袭和迁移的影响，并初步探讨其作用机制。
　　方法：
　　1.利用免疫组织化学方法检测51例结直肠癌患者组织标本中α7烟碱样乙酰胆碱受体(α7nAChR)表达情况，并在同一组织连续石蜡切片中，采用CD68标记结肠癌组织中肿瘤相关巨噬细胞，研究CD68阳性表达中的α7烟碱样乙酰胆碱受体表达与结直肠癌病人发生肝转移及预后的关系。
　　2.利用THP-1细胞作为巨噬细胞模型，利用PMA使之诱导成为巨噬细胞，通过与肠癌细胞间接共培养使之成为肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）。采用siRNA技术下调α7nAChR在巨噬细胞中的表达，并对其进行验证。
　　3.将TAMs与结肠癌细胞LoVo、SW620细胞间接共培养，利用Transwell小室检测TAMs下调α7nAChR后，LoVo和SW620细胞侵袭迁移情况。
　　4.ELISA检测TMs与LoVo细胞间接共培养或者在LPS刺激情况下，巨噬细胞TNF-α的分泌情况。
　　5.Western blotting检测TMs与LoVo细胞共培养后相关信号通路:PI3K、STAT3和NF-κB蛋白的表达情况。并利用相应信号通路的特异性抑制剂来明确α7nAChR的作用。
　　结果：
　　1.CD68高表达于肿瘤间质组织，α7nAChR主要表达于细胞膜表面。在DukesA期病人的结肠癌组织中，CD68高表达而α7nAChR表达量相对较高;在Dukes D期病人的结肠癌组织中，CD68高表达而α7nAChR表达量相对较低。结合临床病理资料以及生存率分析:TAMs表面α7nAChR的表达与患者的性别无关(p=1.0)，与年纪无明显相关性(p=0.455)，而与肿瘤的转移有关:DukesD期的结直肠癌病人其TAMsα7nAChR表达明显降低，14个病人中13个表达小于等于1级，而只有1个病人其TAMsα7nAChR的表达大于等于2级;处于Dukes A/B/C期的病人37人中有20人的TAMsα7nAChR的表达小于等于1级，17个病人的TAMsα7nAChR的表达大于等于2级，差异具有统计学意义(p=0.010)。5年生存率在两组也有显著的差异(p=0.020)。
　　2.慢病毒siRNA干扰技术构建两种单核细胞系THP-1、THP-1α7-/-，经体外诱导成为两种巨噬细胞TM和TMα7-/-，RT-qPCR和Western blotting验证TMα7-/-低表达α7nAChR。
　　3.Transwell结果显示TAMs低表达α7nAChR，LoVo和SW620细胞侵袭和迁移明显增加。细胞迁移实验结果表明:LoVo细胞与TM或者TMα7-/-细胞共培养后，穿膜数量分别为（42±5.354）个和（85.5±9.665）个，p=0.007; SW620细胞穿膜数分别为（8.25±1.315）个和（84.25±10.81）个，p=0.0004。细胞侵袭实验结果显示:LoVo细胞与TM或者TMα7-/-细胞共培养后，穿膜数量分别为（85.5±3.797）个和（258.8±21.51）个，p=0.0002; SW620细胞穿膜数分别为（64.25±4.328）个和（122.5±6.171）个，p=0.0002。差异具有统计学意义。
　　4.ELISA结果发现TAMs敲除α7nAChR在LPS刺激或者与LoVo细胞共培养后，细胞上清中TNF-α的分泌量明显下降。
　　5.相关信号通路研究提示TAMs敲除α7nAChR后，与LoVo细胞共培养，NF-κB p65、STAT3、PI3K p85的磷酸化水平明显下降。特异性信号通路抑制剂实验表明，TAMs抑制α7nAChR的表达后，AG490处理细胞可以明显抑制前者引起的肿瘤细胞迁移的增加，而Ly294002和Bay11-7082处理TMs没有此现象。
　　结论：
　　1.结直肠肿瘤组织浸润的巨噬细胞TAMs表面α7nAChR的表达与结直肠肿瘤转移及预后呈负相关。TAMs上α7nAChR低表达结直肠癌肝转移风险增加，TAMs上α7nAChR高表达结直肠癌肝转移风险降低。
　　2.TAMs可以通过α7nAChR的表达抑制肠癌细胞的侵袭及转移。
　　3.TAMs通过α7nAChR上调NF-α的分泌，提示α7nAChR可调控TAMs转向于促炎作用。
　　4.相关信号通路研究阐明TAMs/α7nAChR可活化NF-κB/STAT3/PI3K信号通路，而TAMsα7nAChR介导的肿瘤细胞侵袭转移下降主要与STAT3信号通路有关。

目录

声明

致谢

摘要

中英文缩略词

1 绪论

1．1 结直肠癌

1．2 肿瘤相关巨噬细胞

1．3 α7烟碱样乙酰胆碱受体(α7nAChR)

1．4 本文的研究目的

2 资料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3 结果

3．1 结直肠癌组织浸润的巨噬细胞(TAMs)表面alpha7烟碱样乙酰

3．2 尼古丁刺激THP-1来源的巨噬细胞可下调α7nAChR的表达

3．3 构建α7nAChR敲低的THP-1细胞

3．4 TAMs通过α7nAChR抑制结直肠癌细胞的侵袭和迁移

3．5 TAMs通过α7nAChR可上调TNF-α仅的分泌

3．6 TAM／α7nAChR可活化NF-κB／STAT3／PI3K信号通路

3．7 抑制STAT3信号通路抑制α7nAChR介导的细胞侵袭迁移

4 讨论

5 结论

参考文献

综述

作者简历及在学期间所取得的科研成果