齐墩果酸衍生物DKS26的抗糖尿病作用及其机制研究

摘要

研究目的：
　　天然化合物齐墩果酸(OA)具有降糖、降脂、保肝、抗炎等多种药理活性，其降糖作用与促进肠促胰素胰高血糖素样肽-1（GLP-1）分泌有关。但是OA的体内降糖作用较弱，并存在潜在的肝毒性，限制了其在糖尿病治疗中的应用。DKS26是一种新的齐墩果酸衍生物，本论文系统研究其体内外抗糖尿病作用，同时考察它对糖尿病小鼠的肝保护作用，以及对正常小鼠的用药安全性;论文还针对DKS26的促GLP-1分泌作用，进一步探讨其潜在的抗糖尿病分子作用机制，为其开发成新型糖尿病治疗药物提供实验依据和理论指导。
　　研究方法：
　　1.DKS26的体外药效学研究
　　(1)DKS26对人肝HepG2细胞葡萄糖消耗的影响
　　采用葡萄糖氧化酶法检测DKS26对HepG2细胞葡萄糖消耗的影响。试验分组为:溶剂对照组、二甲双胍1mM阳性对照组、OA0.1μM、1μM、10μM对照组和DKS260.1μM、1μM、10μM受试组。
　　(2)DKS26对游离脂肪酸(FFAs)诱导脂质蓄积HepG2细胞脂质水平的影响
　　采用甘油三酯(TG)试剂盒、总胆固醇(TC)试剂盒和油红O染色法检测DKS26对FFAs诱导脂质蓄积HepG2细胞脂质水平的影响。试验分组为:正常对照组、FFAs0.25mM模型对照组、苯扎贝特10μM阳性对照组、二甲双胍1mM对照组、OA10μM对照组和DKS2610μM受试组。
　　2.DKS26的体内药效学研究
　　(1)DKS26对STZ诱发糖尿病小鼠的影响
　　ICR小鼠经腹腔注射130mg/kg STZ诱导糖尿病模型(空腹血糖≥11.1mmol/L)。糖尿病小鼠按血糖值大小随机分为4组，分别为STZ模型对照组（n=7）、二甲双胍100mg/kg阳性对照组(n=8)、OA100mg/kg对照组(n=8)和DKS26100mg/kg受试组(n＝8)。同时另设正常小鼠对照组(n＝5)，与STZ模型对照组同样给予与给药组等体积的0.5％CMC-Na。
　　(2)DKS26对db/db糖尿病小鼠的影响
　　db/db小鼠（空腹血糖≥11.1mmol/L）按血糖随机分为4组，每组7-8只，分别为db/db模型对照组(0.5％CMC-Na)、二甲双胍100mg/kg阳性对照组、OA100mg/kg对照组和DKS26100mg/kg受试组。
　　3.DKS26的抗糖尿病分子作用机制研究
　　(1)DKS26对GLP-1表达与分泌的影响
　　采用ELISA法，观察DKS26对肠道内分泌NCI-H716细胞培养上清液和上述两种糖尿病小鼠血浆GLP-1水平的影响。分别采用免疫荧光法、RT-PCR法、ELISA法和Western Blot法，观察DKS26对NCI-H716细胞和小鼠肠道组织GLP-1蛋白原位表达、GLP-1相关基因(gcg和PC3)表达、cAMP含量和p-PKA及PKA蛋白表达的影响。
　　(2)DKS26对人源G蛋白偶联胆汁酸膜受体(TGR5)的影响
　　采用体外报告基因系统筛选模型HEK293/pGL4.29/hTGR5细胞检测DKS26对人源TGR5(hTGR5)的影响。分组为:空白对照组、INT-777阳性对照组、OA对照组和DKS26受试组。
　　4.DKS26对正常小鼠肝功能的影响
　　DKS26对正常ICR小鼠连续给药后，观察小鼠血浆ALT、AST、TBA水平的变化，以考察其对正常小鼠肝功能的影响。分组为:溶剂对照组0.5％CMC-Na、二甲双胍100mg/kg对照组、OA100mg/kg对照组和DKS26100mg/kg受试组。
　　研究结果：
　　1.DKS26的体外药效学研究
　　(1)DKS26对人肝HepG2细胞葡萄糖消耗的影响
　　DKS26可明显增加肝HepG2细胞葡萄糖消耗，该作用与阳性对照药二甲双胍相当。
　　(2)DKS26对FFAs诱导脂质蓄积HepG2细胞脂质水平的影响
　　DKS26可降低FFAs诱导脂质蓄积肝HepG2细胞TG、TC水平，并减少细胞内脂滴含量。
　　2.DKS26的体内药效学研究
　　(1)DKS26对STZ诱发糖尿病小鼠的影响
　　DKS26可明显降低STZ诱发糖尿病小鼠血浆葡萄糖、GSP和脂质水平，改善OGT，并减少饮水量、摄食量，其降血糖作用与二甲双胍相当，明显强于OA;它可增加血浆胰岛素水平和改善胰岛组织形态;还可降低血浆ALT、AST和ALP水平，减少肝脏脂质水平，改善肝脏组织病理形态和抑制肝脏炎症相关基因表达。此外，DKS26可降低小鼠血浆D-BIL和T-BIL水平以及D-BIL/T-BIL比值，降低血浆TBA，同时可缩小模型小鼠增大的胆囊。
　　(2)DKS26对db/db糖尿病小鼠的影响
　　DKS26可明显降低db/db小鼠血浆葡萄糖、GSP和脂质水平，改善OGT，减少饮水量，其降糖和改善OGT的作用与二甲双胍相当，明显强于OA;它可增加血浆胰岛素水平，改善胰岛组织形态;还可降低血浆ALT、AST和ALP水平，减少肝脏脂质水平，改善肝脏组织病理形态和抑制肝脏炎症相关基因的表达。此外，DKS26对小鼠血浆TBA水平和胆囊大小无明显影响;对血浆D-BIL和T-BIL虽有降低作用，但对二者的比值无明显影响。
　　3.DKS26的抗糖尿病分子作用机制研究
　　(1)DKS26对GLP-1表达与分泌的影响
　　DKS26可增加NCI-H716细胞上清液中GLP-1含量，增加细胞内GLP-1蛋白和GLP-1相关基因(gcg和PC3)的表达，并升高细胞内cAMP和p-PKA蛋白的水平。它也可增加STZ诱发糖尿病小鼠和db/db小鼠血浆GLP-1水平，促进肠道gcg和PC3的表达，同时升高肠道内cAMP和p-PKA蛋白的水平，此外还可增加STZ诱发糖尿病小鼠肠道GLP-1蛋白的原位表达。
　　(2)DKS26对人源G蛋白偶联胆汁酸膜受体(TGR5)的影响
　　DKS26在最高浓度100μM时对hTGR5仍无激动效应，而OA对hTGR5具有较弱的激动效应(OA EC50=13.659±1.812μM，阳性对照化合物INT-777EC50=1.765±0.452μM)。
　　4.DKS26对正常小鼠肝功能的影响
　　DKS26连续给药对正常小鼠血浆ALT、AST和TBA水平均无明显影响，但相同剂量的OA可增高这些肝功能损伤相关指标的血浆水平。
　　研究结论：
　　齐墩果酸衍生物DKS26在体内外均具有良好的抗糖尿病作用，其作用机制可能与激活肠道cAMP/PKA信号通路促进GLP-1分泌与表达有关，也可能与激活肝脏AMPK信号通路调节糖脂代谢有关。此外，DKS26对糖尿病小鼠具有肝保护作用，其用药安全性高于齐墩果酸。
　　1.DKS26可增加入肝HepG2细胞葡萄糖消耗，减少FFAs诱导脂质蓄积肝HepG2细胞内脂质水平，其作用机制可能与激活肝AMPK信号通路，下调PEPCK和G6Pase表达、上调GLUT2表达从而降低糖异生、增加糖摄取，以及抑制SREBP-1c和FAS表达、增加PPARα和CPT1表达从而抑制脂肪酸合成、促进脂肪酸氧化有关。
　　2.DKS26连续给药33天可降低STZ诱发糖尿病小鼠的空腹血糖和血脂水平，改善OGT，其降血糖作用与二甲双胍相当，强于OA;可减少饮水量、摄食量改善糖尿病小鼠多饮、多食的症状;可增加血浆胰岛素水平，改善胰岛组织形态发挥胰岛保护作用;可改善肝功能、肝脏组织病理形态、肝脏脂质蓄积和肝脏炎症状态发挥护肝作用。此外，DKS26可降低小鼠血浆TBA水平，减小胆囊，提示其对STZ诱发的糖尿病小鼠用药无胆汁淤积与胆囊充盈的风险。
　　3.DKS26连续给药30天可降低db/db糖尿病小鼠的空腹、随机血糖和血脂水平，其降血糖作用与二甲双胍相当，强于OA;可改善OGT，该作用优于OA;可降低饮水量改善糖尿病小鼠多饮的症状;可增加血浆胰岛素水平，改善胰岛组织形态发挥胰岛保护作用;可改善肝功能、肝脏组织病理形态、肝脏脂质蓄积和肝脏炎症状态发挥护肝作用。此外，DKS26对血浆TBA水平和胆囊大小无明显影响，提示其对db/db糖尿病小鼠用药诱发胆汁酸淤积与胆囊充盈的风险较低。
　　4.DKS26可促进肠道内分泌NCI-H716细胞GLP-1的表达与分泌，其作用机制可能与激活cAMP/PKA信号通路有关。DKS26可增加STZ诱发糖尿病小鼠和db/db糖尿病小鼠血浆GLP-1水平，促进肠道GLP-1蛋白和相关基因(gcg和PC3)的表达，并激活肠道cAMP/PKA信号通路，表明其降血糖、降血脂和胰岛保护的作用机制可能与促GLP-1分泌与表达有关。
　　5.DKS26可激活STZ诱发糖尿病小鼠和db/db糖尿病小鼠肝脏的AMPK信号通路，同时可抑制肝脏PEPCK、G6Pase、SREB P-1c和FAS的表达，并促进GLUT2、PPARα和CPT1的表达，表明其降血糖、降血脂的作用机制可能与激活肝脏的AMPK信号通路，调节与糖脂代谢相关的酶与核转录因子，进而抑制糖异生和脂肪酸合成，并促进糖摄取和脂肪酸氧化有关。
　　6.DKS26对正常小鼠的肝功能无明显影响，而OA可损伤小鼠的肝功能，提示DKS26的用药安全性高于OA。

目录

声明

致谢

摘要

缩写、符号清单、术语表

1 引言

2 实验材料

2．1 实验细胞

2．2 实验动物

2．3 实验仪器

2．4 主要实验试剂

2．5 主要试剂配制

3 实验方法

3．1 DKS26的体外药效学研究

3．1．1 DKS26对人肝HepG2细胞葡萄糖消耗的影响

3．1．2 DKS26对游离脂肪酸诱导脂质蓄积肝HepG2细胞脂质水平的影响

3．2 DKS26的体内药效学研究

3．2．1 DKS26对STZ诱发糖尿病小鼠的影响

3．2．2 DKS26对db／db糖尿病小鼠的影响

3．3 DKS26的抗糖尿病分子作用机制研究

3．3．1 DKS26对人源肠道NCI-H716细胞GLP-1表达与分泌的影响

3．3．2 DKS26对糖尿病小鼠GLP-1 表达与分泌的影响

3．3．3 DKS26对人源G蛋白偶联胆汁酸膜受体(TGR5)的影响

3．3．4 RT-PCR法测定目标基因的表达

3．3．5 Western Blot法测定目标蛋白的表达情况

3．4 DKS26对正常小鼠肝功能的影响

3．5 数据处理

4 实验结果

4．1 DKS26的体外药效学研究

4．1．1 DKS26对人肝HepG2细胞葡萄糖消耗的影响

4．1．2 DKS26对游离脂肪酸诱导脂质蓄积HepG2细胞脂质水平的影响

4．2 DKS26的体内药效学研究

4．2．1 DKS26对STZ诱发糖尿病小鼠的影响

4．2．2 DKS26对db／db糖尿病小鼠的影响

4．3 DKS26的抗糖尿病分子作用机制研究

4．3．1 DKS26对GLP-1 表达与分泌的影响

4．3．2 DKS26对人源G蛋白偶联胆汁酸膜受体(TGR5)的影响

4．3．3 DKS26对肝脏AMPK蛋白表达和糖脂代谢相关基因表达的影响

4．4 DKS26对正常小鼠肝功能的影响

5 讨论

6 结论

参考文献

综述

作者简历及在读期间所获得的科研成果